Este vídeo demonstra a preparação de uma ultra-fina camada de matriz / analito para a análise de peptídeos e proteínas por Matrix Assisted Laser-ionização dessorção Espectrometria de Massa (MALDI-MS).
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Artigo de método
MALDI preparação da amostra: o método de Camada Ultra Thin
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Resumo
Resumo
Este vídeo demonstra a preparação de uma ultra-fina camada de matriz / analito para a análise de peptídeos e proteínas por Matrix Assisted Laser-ionização dessorção Espectrometria de Massa (MALDI-MS) 1, 2. O método de camada ultra-fina envolve a produção de uma camada de substrato de cristais de matriz (alfa-ciano-4-hidroxicinâmicos ácido) na placa de amostra, que serve como um campo de semeadura para a cristalização de uma mistura subseqüentes matriz / analito. Vantagens do método de camada ultra-fina sobre abordagens outra amostra de deposição (gotículas secas, por exemplo) são de que ele fornece (i) maior tolerância às impurezas tais como sais e detergentes, (ii) uma melhor resolução, e (iii) maior uniformidade espacial. Este método é especialmente útil para a determinação da massa exata de proteínas. O protocolo foi inicialmente desenvolvido e otimizado para a análise das proteínas da membrana e utilizado com sucesso para analisar os canais de íons, transportadores metabólito, e receptores, contendo entre 2 e 12 domínios transmembrana 2. Desde a publicação original, também tem mostrado ser igualmente útil para a análise de proteínas solúveis. Na verdade, nós tê-lo usado para um grande número de proteínas tendo uma vasta gama de propriedades, incluindo aqueles com massas moleculares tão alto quanto 380 kDa 3. Hoje é o nosso método de escolha para a análise de massa molecular de todas as proteínas. O procedimento descrito produz consistentemente de alta qualidade espectros, e é sensível, robusto e fácil de implementar.
Protocolo
É muito importante usar luvas sem pó durante a preparação da camada fina.
Limpeza da placa de amostra
- Use um aço inoxidável ou ouro placa amostra MALDI.
- Lavar com MeOH e limpe delicadamente com um Kimwipe. Não esfregue ou esfregar a superfície com o Kimwipe, para evitar arranhar a superfície.
- Lavar com H 2 O e limpe delicadamente com um Kimwipe.
- Lavar com MeOH e limpe delicadamente com um Kimwipe.
- Se necessário, repita MeOH / H 2 O ciclo de limpeza / MeOH, sempre terminando com MeOH.
- Certifique-se que não há manchas fantasma ou resíduo restante no prato. Se houver manchas fantasma, lavar a placa com água deionizada, enquanto esfregando a superfície com a mão enluvada (Não esfregue com Kimwipes). Repita o MeOH / H 2 O ciclo de limpeza / MeOH.
- Use a placa imediatamente após a lavagem.
Preparação da solução fina camada de substrato
- Misture 1 parte de saturada 4 HCCA (2 partes ACN, 1 parte de água, e 0,1% TFA final) e 3 partes de isopropanol.
Nota: A solução de substrato em camada fina é muito estável, e pode ser mantido em temperatura ambiente no escuro durante um ano. Também pode ser armazenado a 4 ° C.
Fazendo a fina camada de substrato
- Aplicar 20 50μL da solução de camada fina de substrato sobre o centro-esquerda do prato, e espalhar com o lado de uma ponta da pipeta. Varredura em uma direção.
- Como a seca solução, a evaporação do solvente orgânico muito rapidamente, deixando para trás gotas minúsculas de água na superfície da placa. Neste ponto, enrole seu dedo indicador com uma camada de Kimwipe e inicialmente suavemente blot a superfície da placa com ele.
- Quando a superfície está livre de pingos de água, limpe toda a placa com uni-direcional movimentos arrebatadores usando um Kimwipe.
Nota: Se a solução não se espalhe o suficiente ao longo da superfície da placa, o aumento da composição ACN e recriar a camada fina. Alguns parâmetros que podem afetar a propagação da solução incluem umidade do ambiente e da temperatura.
Nota: Com placas de ouro, a camada geralmente aparece como um reflexo amarelado, dependendo da visão e ângulos de luz. Com chapas de aço, apenas a borda da camada é normalmente visível. - Limpe as bordas do prato com um Kimwipe fresco antes de o colocar no suporte da placa para evitar a contaminação da matriz de instrumento.
Preparação da solução da matriz
- Saturado de 4 HCCA em FWI (3 partes de ácido fórmico, 1 parte de água, 2 partes de isopropanol) é recomendada para análise de ambas as membranas e proteínas solúveis. Também pode ser usado em casos especiais para a análise de muito hidrofóbicas grandes peptídeos (M> 4.000 u). Certifique-se que a solução matriz utilizada para detectar as proteínas não exceda ~ 50% de conteúdo orgânico, uma vez que irá dissolver completamente o substrato camada fina, derrotando as vantagens do método.
Teste do substrato camada fina
- 0.5μL local da solução matriz na placa. Um precipitado esbranquiçado aparecerá na interface entre a camada fina ea gota. Quando esta camada cobre o fundo da gota inteiramente, geralmente dentro de 10-15 segundos, aspirar o excesso de líquido com uma linha de vácuo. Se demorar mais de 30 segundos para o precipitado para formar, é uma indicação de que pode haver um problema com o substrato em camada fina e / ou a solução matriz.
Aplicação de exemplo
- A concentração do analito nas soluções de partida deve ser no prazo de 10 e 1000μM.
- Diluir a solução do analito em solução de matriz para uma concentração de analito final entre 0,2 e 2μM. Por exemplo, comece com 1μl de amostra e 9μl de solução matriz.
Nota: Certifique-se que a matriz está perto de ser saturada na solução final, caso contrário você vai dissolver o substrato em camada fina.
Nota: As concentrações do analito necessária para obter sinais decente são altamente dependentes da complexidade da solução e composição (por exemplo, contaminantes) e ionizability analito.
Nota: Se uma única etapa de diluição não produz bons resultados, você deve tentar mais um passo de diluição. Embora contra-intuitiva, as soluções de analito altamente concentrada raramente produzem espectros bom.
Nota: as proteínas da membrana geralmente requerem diluições maiores. - 0.5μl ponto de amostra / matriz mistura no prato. Um precipitado esbranquiçado formarão na interface entre a camada fina ea gota. Este precipitado é o cocrystallization da matriz e do analito. Quando esta camada cobre o fundo da gota inteiramente, usualiado dentro de 10-15 segundos, aspirar o excesso de líquido com uma linha de vácuo. Se demorar mais de 30 segundos para o precipitado para formar, pode ser uma indicação de um contaminante presente, o que impede a cristalização, ou o seu analito é muito concentrado.
Aplicação de calibração
- Prepare a mistura de calibração / matriz de uma forma semelhante, com uma concentração final de calibração entre 0,1-0.5μM.
- Local 0.5μl mistura de calibração / matriz sobre a placa em estreita proximidade com os pontos da amostra. Esta proximidade física é usado em um procedimento de calibração pseudo-internas no qual a placa é movido a partir do ponto de amostra para o ponto de calibração durante a aquisição da amostra, para adicionar um disparos de laser alguns dos calibradores para o espectro. Esta abordagem garante uma calibragem maior precisão do que massa de calibração externo.
Lavar passo
- Lave cada local, com aproximadamente 2μL de uma solução de TFA 0,1% gelada aquosa. Aspirar o excesso de líquido com uma linha de vácuo.
Aquisição de espectros de massa
- Agora você está pronto para adquirir espectros de massa. Se você usar a solução matriz FWI, você deve adquirir o seu espectro o mais rapidamente possível para impedir a modificação irreversível ao analito, tais como formylation.
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Materiais
É fundamental que todos os reagentes são de alta qualidade (por exemplo, HPLC).
Luvas sem pó (látex ou nitrilo)
Aço inoxidável ou ouro placa amostra MALDI
Metanol (MeOH)
Água
Kimwipes
alfa-ciano-4-hidroxicinâmicos ácido (4-HCCA)
Trifluoroacético ácido (TFA) (concentração final em 0,1% em H 2 O)
Acetonitrila (ACN)
Ácido fórmico
Isopropanol
Referências
- Xiang, F., Beavis, R. C. A Method to Increase Contaminant Tolerance in Protein Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization by the Fabrication of Thin Protein-Doped Polycrystalline Films. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).
- Cadene, M., Chait, B. T. A Robust, Detergent-Friendly Method for Mass Spectrometric Analysis of Integral Membrane Proteins. Analytical Chemistry. 72, 5655-5658 (2000).
- Hook, P., Mikami, A., Shafer, B., Chait, B. T., Rosenfeld, S. S., Vallee, R. B. Long-range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains. J Biol Chem. 280, 33045-33054 (2005).
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Reimpressões e permissões
