Summary
מיתרי הטבור משמשים כדי לבודד לתאי שריר חלק על ידי דרכים שונות. בעבודה זו השתמשנו טיפול אנזימטי כדי לבודד לתאי שריר חלק.
Abstract
חבל הטבור האנושי (UC) היא מדגם ביולוגי שניתן להשיג בקלות רק לאחר הלידה. זה מדגם ביולוגי, רוב הזמן, מושלך ואיסוף שלהם אינה מעידה על כל סיכון נוסף בריאות היילוד או של אמו. יתר על כן חששות לא אתית גדלים. UC מורכב ידי וריד אחד ושני עורקים שממנו הן בתאי האנדותל (ECS)
Protocol
- העורקים מתקבלים UC חתיכות של 3-7 ס"מ.
- ג'לי וורטון של שמקיפה את העורקים הוסר בקפידה על ידי גזירה במספריים זה.
- מחט קהה סוף בקוטר חיצוני של 0.6-1mm הוכנס על 7mm מקצה אחד של העורקים גזור.
- כדי להסיר את הדם שנותר בתוך כלי הדם, העורקים מוחזקים אנכית perfused עם כ 20-40 מ"ל, תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS), באמצעות מזרק 20 מ"ל קשור מחט. אם יש צורך, בשלב זה כביסה חזר על עצמו כמה פעמים.
- הנוהל חזר על עצמו אותו משתמש RPMI 1640 בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS).
- אחת הגפיים של כלי הדם נסגר. מזרק 10 מ"ל היה קשור מחט ו perfused עם 3 מ"ל של collagenase סוג אני (800 יחידות / מ"ל בפתרון שנאגרו של האנק מלח (HBSS)). ואז extremityof שני כלי נסגר גם הוא.
- הספינה הודגר עם פוספט שנאגרו תמיסת מלח (PBS), במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בהתרגשות.
- אחרי הקצוות של כלי קוצצו כדי לאסוף את SMCs חינם. העורקים היו perfuse עם מ"ל כ 20 עד 40 מתוך DMEM-F12 בתוספת 5% FBS ו אנטיביוטיקה כדי שפופרת 50 מ"ל.
- הצינור היה centrifuged בטמפרטורת החדר (250 גר ', 8 דקות), ותא גלולה היה resuspended ב 5 מ"ל של DMEM-F12 בתוספת 5% FBS.
- השעיית תא הועבר קולגן מצופה T-בקבוק וטופחו על 37 ° C, תחת אווירה של 5% CO 2 humidified.
- לאחר 16 שעות 5, הלא חסיד תאים drebis הסלולר הוסרו, 5 מ"ל של מדיום תרבות נוספה התאים הודגרו ב 37 ° C, תחת אווירה של 5% CO 2 humidified.
- תרבות התקשורת התא שונה כל 2 3 ימים, עד SMCs הגיעו למפגש.
- לאחר המפגש הגיע תאים שהם זורעים לתוך שניים או שלושה 25 ס"מ 2 T-צלוחיות.
ניקוי
- השלך מחטים במיכל החדים.
- השלך מזרקים במיכל Biohazard גדול.
- מכניסים את כל רקמת לשקית Biohazard קטן. סגור את השקית להקפיא ב -20 מעלות צלזיוס עד שריפה.
- משרים את כל המכשירים virucide דקות לפחות 10.
- חזור התקשורת בשימוש למקרר.
- השלך את הכפפות פסולת Biohazard.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SMC יכול לשמש כמודל עבור מבחני העתיד עם תרופות נחש, לבודד מבנית לאפיין L-סוג ערוצי סידן, ללמוד היבטים תאית ומולקולרית של תפקוד כלי הדם, ולהשתמש בהם בהנדסת רקמות. SMCs ו ECS הם היסוד לפיתוח biomaterials חדש שיכול לשמש בייצור של כלי דם סינתטי למחצה לשימוש בבני אדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
החולים אמאטו Lusitano, קסטלו ברנקו מפורטוגל.
החולים סוזה מרטינס, Guarda פורטוגל.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM-F12 | Sigma-Aldrich | 095K8311 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biochrom AG | 0117T | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 3103806 | |
| Collagen | Sigma-Aldrich | 067K2302 | |
| Antibiotic | 10 μL/ 1 mL of medium | ||
| Scissors | Sterilized | ||
| Needle | Diameter of 0.6-1mm | ||
| Syringe | 10 - 20 mL | ||
| Physiological Saline Solution (PSS) | 20-40 mL per artery | ||
| Collagenase type I | Sigma-Aldrich | 047K1052 | 3 mL per artery |
| Hank’s Buffered Salt Solution(HBSS) | Diluted collagenase | ||
| Phosphate buffered saline solution (PBS) | Warmed to 37°C |
References
- Van Rijen, H. Gap junctions in human umbilical cord endothelial cells contain multiple connexins. The American journal of physiology. 272 (1 PT 1), C117-C117 (1997).
- Martín de Llano, J. Procedure to consistently obtain endothelial and smooth muscle cell cultures from umbilical cord vessels. Translational Research. 149 (1), 1-9 (2007).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
- Cairrão, E., Santos-Silva, A., Alvarez, E., Correia, I., Verde, I. Isolation and culture of human umbilical artery smooth muscle cells expressing functional calcium channels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 45 (3), 175-184 (2009).
