Summary
Questo video mostra esperimenti con successiva analisi delle interazioni proteina-proteina mediante l'uso di micro-fantasia superfici. L'approccio offre la possibilità di rilevare le interazioni delle proteine nelle cellule viventi e combina le elevate capacità di throughput con la possibilità di estrarre informazioni quantitative.
Abstract
Svelare la rete di interazione delle molecole
Protocol
Microcontatto stampa:
- Tagliare campo della micropattern del timbro PDMS con un bisturi
- Lavare il campo contenente il micropattern dal lavaggio con etanolo (100%) e acqua distillata.
- Secco il timbro PDMS con azoto o gas argon.
- Pipettare 50 microlitri BSA-Cy5 soluzione di lavoro (0,67 mg / ml) sul timbro PDMS in modo che l'intero campo micropattern è coperto con una soluzione. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare il campo micropattern da lavaggio con soluzione tampone fosfato (PBS) e acqua distillata.
- Asciugare il PDMS con azoto o gas argon.
- Inserire il timbro PDMS sotto il proprio peso sul mezzo di una resina epossidica rivestite coprioggetto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente in una capsula di Petri.
- Etichetta la posizione del timbro PDMS sul retro del vetrino e nastri il timbro dalla diapositiva con una pinza.
- Bastone di una scheda Secure camera di ibridazione Sigillo il microcontatto stampato campo sul vetrino. L'etichetta consente di localizzare il centro del campo.
- Pipettare 60 microlitri lavoro soluzione streptavidina (50 mg / ml) nella camera di reazione e incubare il campione per 60 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare il campione con 1 ml di PBS con l'aggiunta del tampone in una porta della camera e la rimozione contemporaneamente alla seconda porta con una pompa.
- Pipettare 60 microlitri biotinilato lavoro soluzione di anticorpi (10 mg / ml in PBS integrato con 0,1% di Tween 20; "PBST") nella camera di reazione e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare il campione con 1 ml PBST e successivamente 1 ml di PBS con l'aggiunta del tampone in una porta della camera e la rimozione di nuovo alla seconda porta con una pompa.
- Conservare le superfici micropatterned in PBS al buio a temperatura ambiente fino a quando le cellule sono pronte per la semina.
L'incubazione delle cellule sulla superficie micropatterned:
- Crescere cellule aderenti al 50% confluenza in un piatto 3 coltura del tessuto cm.
- Staccare cellule che esprimono proteine esca e preda di interesse con l'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), soluzione e centrifugare 5 min a 1.000 giri al minuto.
- Eliminare il supernatante e sciogliere il pellet di cellule nel mezzo di crescita secondo.
- Centrifugare 5 min a 1.000 giri al minuto.
- Eliminare il supernatante e sciogliere il pellet di cellule nel terreno di coltura appropriato.
- Sostituire la PBS dalla camera di reazione sul vetrino micropatterned da 60 ml di sospensione cellulare.
- Creare una camera umidificata immergendo un tampone sterile in acqua distillata e di metterlo in scatole Petri per evitare che il campione di marcia a secco.
- Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C in un 5% di CO 2 nell'atmosfera sulle superfici micropatterned.
- Prima di analizzare le cellule al microscopio, cambio del mezzo di soluzione salina tamponata Hank s tra cui Ca 2 + e Mg 2 +.
Microscopia:
- Il coprioggetto è posto su un supporto adatto e la morfologia delle cellule è verificata in luce bianca.
- La qualità del-Cy5 BSA modelli è controllato da eccitazione a 647 nm.
- Microdisegni preda di proteine fluorescenti (GFP o YFP) sono registrati a 488 o 514 nm in riflessione interna totale (TIR) eccitazione.
Rappresentante dei risultati:
Se c'è interazione tra le proteine bersaglio nelle cellule coltivate su una superficie micropatterned, la preda seguirà la redistribuzione esca. Il micropattern risultante può essere visualizzato dal marchio fluorescenza della proteina preda. È importante sottolineare che il contrasto ottenuto fornisce una misura diretta della forza di interazione (vedi Figura 1). Quindi una semplice valutazione della interazione di due proteine diventa possibile - senza la necessità di elaborare ulteriormente i dati misurati primario.
Figura 1. Riordino della esche vive nella membrana plasmatica delle cellule a diversi punti di forza di interazione. TIR immagini di cellule transfettate con T24 (a) CD71-GFP su anticorpi CD71-, (b) CD4 e YFP citosolica su CD4-anticorpo e (c) GPI-GFP-DAF sulla CD59-anticorpo microbiochips sono mostrati. I dati sono caratteristici di una forte (a), no (b) o l'interazione debole (c). (A) è riprodotto da (Weghuber et al., In stampa), (b) da (Schwarzenbacher et al., 2008).
Discussion
Il video che accompagna illustra un metodo per la rilevazione di interazioni proteina-proteina nel plasma-membrana delle cellule viventi (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, in stampa). In linea di principio, qualsiasi TIRF piattaforma basata su microscopia può essere utilizzato come sistema di lettura. Solo quando si vuole un'elevata sensibilità (ad esempio per la rilevazione di singole molecole), microscopi avanzato sarà richiesto. Per ottenere i migliori risultati i seguenti punti critici durante il processo di preparazione richiedono particolare attenzione:
- Conservare Cy5-stock soluzione in condizioni di buio per evitare lo sbiancamento del fluoroforo e preparare la BSA-Cy5 soluzione lavoro appena prima della stampa microcontact.
- Fare attenzione a non graffiare la micropattern sul PDMS con la punta della pipetta e incubare il campione in condizioni di buio per evitare lo sbiancamento del fluoroforo.
- Mettere il vetrino su un tampone sterile per evitare che si attacchi del vetrino alla capsula di Petri. Una volta che il timbro PDMS ha aderito al vetrino, non muoversi.
- Evitare bolle d'aria nella camera di reazione e incubare il campione in condizioni di buio per evitare lo sbiancamento del fluoroforo.
- Non lasciate che il campione secco per più di 2 minuti per evitare la formazione di cristalli di sale.
- Per il distacco delle cellule non usare tripsina come sarà unirà il dominio extracellulare di proteine di membrana finora espresso. Evitare tripsina sarà utile per le proteine con basso tasso di turnover per formare microdisegni subito dopo l'attaccamento delle cellule sulla superficie.
- Controllare il numero di cellule incubate in un microscopio e fare in modo che le cellule non raggiungono più del 30-50% confluenza. Assicurarsi che le cellule vengono rimosse immediatamente eccessivo a causa del fissaggio rapido delle cellule sulla legate agli anticorpi di superficie.
- Solo con diapositive di alta qualità BSA-Cy5 modelli possono essere utilizzati per ulteriori analisi.
- Espressione stabile della proteina fluorescente preda è preferibile a causa di un maggior numero di cellule che possono essere analizzati per scansione.
- Un'adeguata regolazione TIRF è indispensabile per visualizzare modelli a causa di sfondo citosolico.
Il micro-patterning tecnica offre numerose opportunità per l'analisi delle interazioni proteina-proteina. In primo luogo, insieme con la quantificazione dei locali, risolta spazialmente interazioni proteina-proteina anche la rilevazione delle interazioni deboli o indiretta è possibile senza lo svantaggio di dare un elevato numero di falsi positivi o negativi. In secondo luogo consente al ricercatore di analizzare le interazioni proteina-proteina nel plasma-membrana di cellule vive, che è difficile da raggiungere da approcci biochimici come il 2-ibrido schermo. In terzo luogo l'approccio consente la rilevazione di esca-preda interazioni che sono modulati da cambiamenti ambientali come la temperatura, la presenza di diverse proteine o altre molecole o modificazioni post-traduzionali. Così il test permette di modulatori proiezione di una coppia data interazione nel contesto delle cellule vive. Inoltre, riducendo la densità superficiale del ligando cattura o l'uso di leganti monovalente, l'analisi dello stato di riposo diventa possibile. Infine, se adeguatamente le piattaforme di scansione vengono utilizzati, il numero di cellule analizzate è abbastanza alto per soddisfare domande throughput elevato delle aziende farmaceutiche per lo screening di stupefacenti (Ramm, 2005).
Disclosures
Il video contiene immagini che sono stati forniti da Olympus, tratto dal sito del Laboratorio di Ricerca di visualizzazione, Brown University o riprodotti da (Kim et al., 2003).
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Quentina Beatty, Università di Linz, in Austria, per il suo gentile aiuto, Katharina Strub, Università di Ginevra, in Svizzera, per la hCD71-GFP costruire, e Daniel Legler, Università di Costanza, in Svizzera, per il GPI-GFP DAF-costruire. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo austriaco della scienza (FWF; progetto Y250-B03) e il GEN-AU progetto del Ministero federale austriaco per la Scienza e la ricerca.
References
- Brameshuber, M., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schuetz, G. J. Reply to "Uncoupling diffusion and binding in FRAP experiments. Nat. Methods. 6, 183-184 (2009).
- Kim, P. W., Sun, Z. J., Blacklow, S. C., Wagner, G., Eck, M. J. A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8. Science. 301, 1725-1728 (2003).
- Ramm, P. Image-based screening: a technology in transition. Curr. Opin. Biotechnol. 16, 41-48 (2005).
- Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Brameshuber, M., Hesch, C., Paster, W., Weghuber, J., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Micropatterning for quantitative analysis of protein-protein interactions in living cells. Nat. Methods. 5, 1053-1060 (2008).
- Weghuber, J., Brameshuber, M., Sunzenauer, S., Lehner, M., Paar, C., Haselbruebler, T., Schwarzenbacher, M., Kaltenbrunner, M., Paster, W., Heise, B., Sonnleitner, A., Stockinger, H., Schutz, G. J. Detection of protein-protein interactions in the live cell plasma membrane by quantifying prey redistribution upon bait micropatterning. Methods in Enzymology. , Forthcoming Forthcoming.
