数字微镜装置（DMD）能够生成复杂的时间和空间光图案，用于控制神经元的兴奋性。本文讨论了DMD系统的设计、构建和操作中的相关问题。此类系统已成功实现了对远端树突分支点间非线性整合的验证。
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方法文章
利用数字微镜装置进行模式化光刺激以研究树突分支点处的整合功能
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
光是一种多功能且精确的调控神经元兴奋性的手段。近年来，光敏效应分子如通道视紫红质（channel-rhodopsin）和笼锁型神经递质（caged neurotransmitters）的引入，激发了人们对开发更优方法以在空间和时间上精确控制光模式的兴趣，这些方法在实验神经科学中具有重要应用价值。一种传统策略是在共聚焦和双光子显微镜中采用的方法，即将光聚焦到一个衍射极限的光斑，然后依次扫描该光斑覆盖目标区域。当需要在短时间内刺激较大区域时，这种方法会遇到困难，这一问题在光刺激实验中比在成像中更为突出。另一种替代策略是借助数字微镜装置（DMD）将完整的空间光模式投射到目标区域。DMD方法具有吸引力，因其硬件组件相对便宜，并且有商业支持。由于目前尚无适用于直立显微镜的现成DMD系统，本文将讨论此类DMD系统构建与操作中的关键问题。尽管我们主要描述的是用于紫外光解（UV photolysis）的系统构建，但也会提供构建更为简单的可见光系统以用于光遗传学实验的修改方案。该紫外光解系统已被用于开展神经科学中一个基础问题的研究：空间分布的输入信号如何在远端树突分支点之间进行整合。实验结果表明，这种整合在分支点之间可能呈现非线性特征，且超线性整合主要由NMDA受体介导。
方案
一般设计考虑
如果光刺激的波长位于可见光范围内，例如在光遗传学实验中，系统的光路布局将比紫外光解实验简单得多。此时只需从各显微镜厂商处购买双相机接口模块即可。数字微镜装置（DMD）平面可被放置在两个相机接口中任意一个的共轭像平面位置上。但在紫外光解实验中，来自DMD的光必须通过落射式照明光路引入（图3A），因为目前所有商用显微镜中通往相机的成像管镜均未针对紫外波长进行校正。在350 nm波长下，成像管镜的球面像差严重，导致无法将光聚焦成一个精细的光斑，也无法实现足够的空间分辨率。这一问题在共聚焦显微镜中不会出现，因为在沿相同光轴引入准直激光束时，管镜会被移除。通过落射荧光光路引入紫外光可解决该问题，因为该路径中的管镜均在一定程度上对紫外波长下的球面像差进行了校正。关于显微镜光学系统，我们可以根据期刊的要求进行任意深度的阐述。科学界普遍对此类主题兴趣浓厚，但目前能够清晰讲解这一内容的资料来源尚不多见。
为了尽量减少对显微镜的改造，并考虑到落射荧光单元空间有限，将数字微镜器件（DMD）置于由中继透镜新创建的共轭像平面处（指出DMD单元相对于显微镜的位置）。选用了一款商用的紫外校正中继透镜（Specialty Optics）（在图示和显微镜上标出该透镜的位置）。
DMD的光照
当接收到二进制输入信号后，微镜可在相对于芯片平面....
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讨论
基于DMD的光刺激方法的优势在目标区域相对较大时最为明显。如果感兴趣的目标非常小，例如少数几个树突棘，则顺序扫描共聚焦和双光子系统可能是更合适的方法。DMD方法的一个显著缺点是其对可用光源的利用效率较低，大部分可用光必然被导向“关闭”状态的微镜而未被利用。
基于DMD的系统最适合在可见光范围内运行。我们预计，基于DMD的光刺激系统在与光遗传学实验结合使用时将产生重要影响。
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致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）的RO1项目、退伍军人事务部研究服务的杰出研究评审项目对C.-M. T.的资助，以及对C.W.L.的个人国家研究服务奖（NRSA）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 现代直立式荧光显微镜 | |||
| CCD相机及图像采集软件 | |||
| 计算机及数据采集/接口系统 | |||
| DLP Discovery 开发套件 | |||
| ALP3 USB 接口 | |||
| S2 + 光学组件（带LED） | |||
| 双相机接口单元 | |||
| 355 nm 三倍频 NdVO4 激光器（约 1 W） | DPSS Laser Inc. | ||
| 激光快门 Model LS6 | Uniblitz | ||
| 多模光纤及光纤拉伸器 Model# 915 | Canadian Instrument and Research, Ltd | 100 μm 芯径多模光纤 | |
| 多模光纤耦合器 | Oz Optics | ||
| 信号发生器 | 最高 50 kHz | ||
| 光束准直器 | Olympus Corporation | DApo20UV340 | |
| 紫外中继透镜 | Special Optics | #: 54-25-60-355 |
参考文献
- Scanziani, M., Hausser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461, 930-939 (2009).
- Tang, C. Photolysis of caged neurotransmitters: Theory and procedures for light delivery. Curr. Prot. Neurosci. , 6.21.1-6.21.12 (2006).
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points
Posted by JoVE Editors on 3/24/2011. Citeable Link.
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