إنشاء الابتدائية الثقافات الليفية الكبار من القوارض

Summary

توضح هذه المقالة بروتوكول للعزلة وصيانة الثقافات الليفية الأولية من الجلد وأنسجة الرئة من القوارض البرية.

Abstract

أهمية استخدام الخلايا الأولية ، بدلا من خطوط الخلايا السرطانية ، للدراسات البيولوجية أصبح من المسلم به على نطاق واسع. ويفضل الخلايا الأولية في دراسات الخلايا دورة الخلية ، والسيطرة ، وإصلاح الحمض النووي ، كما الخلايا السرطانية تحمل طفرات في الجينات المسؤولة عن هذه العمليات. لا يمكن أن يكون مثقف الخلايا الأولية اجل غير مسمى بسبب ظهور الشيخوخة أو تنسخي aneuploidization. وبالتالي ، ثقافات جديدة تدعو الحاجة إلى وضع بانتظام. راسخة الإجراء لعزل الخلايا الليفية القوارض الجنينية ، ولكن عزل الثقافات الليفية الكبار غالبا ما يقدم تحديا. قد الليفية القوارض الكبار معزولة عن نماذج الماوس من الأمراض التي تصيب الإنسان تكون السيطرة المفضل عند مقارنتها الليفية من المرضى من البشر. علاوة على ذلك ، لا أخلاقي الليفية هي المادة الوحيدة المتاحة عند العمل مع القوارض البرية التي لا يمكن فيها الإناث الحوامل يمكن الحصول عليها بسهولة. هنا نقدم بروتوكول للعزلة وثقافة الليفية الكبار من القوارض الجلد والرئتين. استخدمنا هذا الإجراء بنجاح لعزل الخلايا الليفية من أكثر أنواع القوارض العشرين من الفئران والجرذان المختبرية على القوارض البرية مثل القندس ، النيص ، والسنجاب.

Protocol

1. قبل بدء

1. مقص وملقط تعقيم مع الايثانول 70 ٪.
2. مكان مغناطيسي صغير داخل دورق 30 مل ، وتغطي مع اثنين من طبقات من احباط ، وموصدة.
3. إعداد 28 وحدة ونش / مل محلول المخزون من Blendzyme Liberase 3 في الماء المعقم. جعل aliquots 0.5 مل والتجميد في -20 درجة مئوية. أذاب a قسامة جديدة قبل كل استخدام. قد يبدو الحل غائما بعد الذوبان. دوامة الحل حتى يصبح واضحا.
4. الاحماء وسائل الإعلام ثقافة الخلية.

Discussion

الليفية الأولية الطبيعية تقدم بديلا ممتازا لإنشاء خطوط الخلايا السرطانية في مجال البحوث البيولوجية. ميزة هامة من الخلايا الليفية هو أنها لا تحمل طفرات في الجينات المسرطنة والمكثفات ورم سليمة والحفاظ على نقاط التفتيش دورة الخلية. وهذا يجعل الخلايا الليفية العادي يفضل نظاما للدراسات لتنظيم دورة الخلية ، وإصلاح الحمض النووي ، وموت الخلايا المبرمج. بروتوكول الموصوفة هنا يقدم وصفة بسيطة للعزلة وصيانة الليفية الأولية. وقد استخدم هذا البروتوكول لعزل الخلايا الليفية بنجاح لأكثر من 20 نوعا.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM / F12 media	Invitrogen	11330-032
مصل الأبقار الجنينية (FBS) ،	Invitrogen	المؤهل 01437-036	تم اختبار المصل المؤهل مسبقا لتوفير دعم جيد للنمو للأرومات الليفية الأولية.
المضادات الحيوية / المضادة للفطريات	Invitrogen	15420-096
البنسلين / الستربتومايسين	Invitrogen	15140-122
Liberase TM Research Grade< / strong>	Roche	05401127001< / strong>	Replacement Enzyme.
ملاحظة من المؤلفين: منذ أن أوقفت روش Liberase Blendzyme 3 (11814184001) ، فإنها توصي باستخدام Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg ، Cat. no. 05401127001 - 100 mg) بدلا من ذلك. لقد تحولنا إلى هذا الإنزيم بنجاح دون أي مشاكل.
وسائط EMEM	ATCC	30-203	تحتوي وسائط EMEM من ATCC بالفعل على أحماض أمينية غير أساسية وبيروفات الصوديوم.
ريش # 21 مشرط معقم يمكن التخلص منه متعدد	الموردين
ثلاثة حاضنة للتحكم في الغاز	فورما أو هيريوس