이 문서는 고립과 야생 설치류 동물의 피부와 폐 조직에서 기본 fibroblast 문화의 유지 관리를위한 프로토콜을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
생물 학적 연구, 기본 세포보다는 암 세포 라인을 사용하는의 중요성이 널리 인식되고 있습니다. 차 전지는 세포주기 조절, apoptosis 연구에서 선호하고, DNA의 수리, 암 세포는이 과정에 관련된 유전자에 돌연변이 들고와 같습니다. 차 전지는 무기한 replicative의 노화 또는 aneuploidization의 발병으로 인해 양식 수 없습니다. 따라서, 새로운 문화 정기적으로 설립해야합니다. 쥐 배아 섬유아 세포의 격리에 대한 절차는 잘 구축지만, 종종 도전을 선물 성인 fibroblast 문화를 격리합니다. 인간의 환자에서 섬유아 세포에 비교하면 인간의 질병의 마우스 모델에서 절연 성인 쥐 섬유아 세포가 원하는 컨트롤 수 있습니다. 임신 여성은 쉽게 얻을 수없는 야생 설치류 작업을 할 때뿐만 아니라, 성인 섬유아 세포는 물질에만 사용할 수 있습니다. 여기 쥐 피부와 폐 섬유아 세포에서 성인의 격리와 문화 프로토콜을 제공합니다. 우리는 실험실 마우스 및 쥐에서 같은 비버, 고슴도치, 다람쥐와 같은 야생 및 설치류에 스무 쥐여 종의에서 섬유아 세포를 분리하기 위해 성공적으로이 절차를 사용합니다.
프로토콜
1. 시작하기 전에
- 70 % 에탄올과 가위와 집게를 소독.
- 30 ML의 비커 내부에 작은 자기 활동가를 놓고 두 호일의 레이어, 그리고 압력솥로 커버.
- 멸균 물 속에 28 Wunsch 단위 / Liberase Blendzyme 3 ML 주식 솔루션을 준비합니다. -20 ° C.에서 0.5 ML aliquots 및 동결 만들기 모든 사용하기 전에 새로운 나누어지는를 녹여. 이 솔루션은 해동 후 흐림 나타날 수 있습니다. 소용돌이 솔루션을 분명히 될 때까지.
- 세포 배양 미디어를 따뜻하게.
2. 동물 샘플 준비
주의 : 야생 동물은 광견병 바이러스로 병원균을 포함할 수 있습니다. 항상 열려있는 샵스 인식합니다.
- 동물을 안락사 4에서 시체를 배치 ° C. 동물이 분야에서 수집하는 경우로이 같은 실용적하지 않은 경우 그것은 그러나, 바로 시체를 사용하는 것이 가장 좋습니다, 시체는 24 시간 이내에 사용할 수 있습니다. 24시간 세포 항복 거부 후.
- (하지 조직 문화 후드에서) 수술 스위트 또는 화학 후드에있는 동물을 해부하다.
- ....
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토론
일반 기본 섬유아 세포 생물 학적 연구에 설립 암 세포 라인에 대한 훌륭한 대안을 제공합니다. 섬유아 세포의 중요한 이점은 그들이 oncogenes 및 종양 진압에 변이를 수행하고 그대로 세포주기 검문소를 유지하지 않는 것이있다. 이것은 정상적인 섬유아 세포 세포주기 조절, DNA 수리 및 apoptosis의 연구 선호하는 시스템이 있습니다. 여기에서 설명한 프로토콜은 절연 및 기본 섬유아 세포의 유지 보수를위한 간단한 조리법을 제공합니다. 이 프로토콜은 성공적으로 설치류 20 종 이상의 섬유아 세포를 분리하는 데 사용되었다.
오염을 피하기 위해 세포 배양 작업을 할 때 항상 불임을 유지하는 것이 중요합니다. 연구소는 또한 문화와 같은 헬라 세포와 같은 적극적인 암 세포 라인을 경우, 섬유아 세포는 암세포에서 별도로 취급해야합니다. 이것은 기본 문화에 대한 지정 후드 및 배양기를 가지고 좋습니다.
그것은 3 %의 생리 산소 .......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는이 프로토콜의 첫 번째 버전으로 우리를 제공할 박사 스티븐 Austad 감사합니다. 이 작품은 NIH와 엘리슨 의료 재단에서 VG에 부여하여 이름으로 지원했습니다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 배지 | Invitrogen | 11330-032 | |
| 소태아혈청 (FBS), Qualified | Invitrogen | 01437-036 | Qualified 혈청은 일차 섬유아세포의 원활한 성장을 지원하도록 사전 테스트되었습니다. |
| 항생제/항진균제 | Invitrogen | 15420-096 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Invitrogen | 15140-122 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05401127001 | 대체 효소. |
| 저자 참고 사항: Roche에서 Liberase Blendzyme 3 (11814184001)의 생산을 중단함에 따라, 대신 Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) 사용을 권장합니다. 본 연구진은 이 효소로 성공적으로 전환하였으며 아무런 문제가 없었습니다. | |||
| EMEM 배지 | ATCC | 30-203 | ATCC의 EMEM 배지에는 이미 비필수 아미노산과 피루브산 나트륨이 포함되어 있습니다. |
| Feathered #21 일회용 멸균 메스 | 다수 공급처 | ||
| 3-가스 제어 배양기 | Forma 또는 Heraeus |
참고문헌
- Seluanov, A. Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging . Cell. 7, 813-823 (2008).
- Parrinello, S. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts.
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재인쇄 및 허가
