Method Article

Хроматин Иммунопреципитация (чип) с Пробирной Динамический гистонов Внесение изменений в Активированный экспрессии генов в клетках человека

DOI:

10.3791/2053

⸱

July 29th, 2010

 ,  , 
1Department of Biology, University of Virginia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает, как хроматин иммунопреципитации (чип) используется для изучения динамических изменений хроматина шаблон, который регулирует транскрипцию индуцированных пути передачи сигнала.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В ответ на различные внеклеточные лиганды, STAT (преобразователь сигнала и активатор транскрипции) транскрипционные факторы быстро набираются из своего латентного состояния в цитоплазму, чтобы рецепторами клеточной поверхности, где они приводятся в действие фосфорилирования в одной остаток тирозина 1. Затем они димеризуются и транслокации в ядро ​​для управления транскрипцию генов-мишеней, влияющих на рост, дифференцировку, гомеостаза и иммунного ответа. Не удивительно, учитывая их широкое вовлечение в нормальных клеточных процессов, нарушение регуляции функции STAT способствует болезни человека, в частности, рака 2 и аутоиммунных заболеваний 3.

Хорошо известно, что транскрипции регулируется изменений хроматина шаблон 4,5. Эти изменения включают деятельность АТФ-зависимых комплексов, а также ковалентные модификации гистонов и метилирования ДНК 6. Потому что СТАТ активации экспрессии генов является одновременно быстрый и преходящее, она требует конкретных механизмов для модуляции хроматина шаблон на STAT-зависимых локусы генов. Чтобы определить эти механизмы, мы характеризуем модификации гистонов и ферментативных активностей, которые их в генных локусов, которые отвечают на STAT сигнализации. Этот протокол описывает хроматин иммунопреципитации, метод, который является ценным для изучения СТАТ сигнализации с хроматином в активированных экспрессии генов.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПЛАНИРОВАНИЕ

Накануне ChIP эксперимента планируется, камеры должны быть культурными, так что их достаточное число. Предположим, что каждый чип анализа потребуется ~ 1-1,5 х 10 7 клеток. Всегда планирую сделать как отрицательное (IgG) и положительных (панорамирование гистонов антитело) управления и дублировать эксперименты.
Совет - Для 2FTGH клеток, каждый чип анализ требует около 15 см культуре ткани блюдо на 80% слияния.

ЧАСТЬ 1: Подготовка ХРОМАТИНА и выполнять ChIP

  1. Удалить культуру средств массовой информации и вызывают клеток для раз требуется 20 мл 10% космических....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ChIP протоколе изложены успешно используется в лаборатории для анализа более чем двадцати различных модификаций гистонов. Кроме того, мы охарактеризовали изменения в размещении транскрипционных факторов, гистон-модифицирующие ферменты, белки, которые признают модификации гистонов и РНК-полимеразы II транскрипции машин, в нескольких IFN-γ индуцированных генов. Мы также использовали процедуру, чтобы охарактеризовать изменения в модификации гистонов при дифференциации стволовых раковых клеток 10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа проводится при поддержке Университета Вирджинии, Университета штата Вирджиния онкологический центр и Томас Ф. и Кейт Миллер Джеффресс Мемориал Trust. Мы благодарим Джеймс Э. Дарнелл Lab (Rockefeller University) Роберт Росс Lab (Fordham University) для клеточных линий.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
37% формальдегидаFisher ScientificBP531-500
Хлороформ/изоамиловый спиртAcros OrganicsAC32715-5000
Полные мини-ингибиторы протеазыRoche Group1836153
Cosmic Calf SerumHycloneSH30087.04N
DMEM HycloneSH30243
DTTSigma-AldrichD0632
EDTAFisher ScientificBP118-500
ЭтанолPharmco Products, Inc.zp1110EP
ГлицинРош Группа100149
гликогенRoche Группа901393
HEPESSigma-AldrichH3784
ИФН-гаммаR& D Systems285-IF-100
IgGJackson ImmunoResearch109-005-003
KClMP Biomedicals
LiClSigma-AldrichL4408
MgCl2Sigma-AldrichM8266
Ацетат натрияFisher ScientificBP333-500
дезоксихолевый Кислая натриевая сольFisher ScientificBP349-100
NaClFisher Scientific7647-14-5
NP40US BiologicalN3500
Антигистон H3, CT, panEMD Millipore07-690
Фенол/хлороформ/изоамилFisher Scientific108-95-2
Фосфат буферизованный физиологический растворFisher Scientific7647-14-5
PMSFEMD Millipore50-230-0316
Proteinase K5 PRIME2500140
RNAse A5 PRIME2500130
ДНК/белок спермы лосося A AgaroseEMD Millipore16-157
ДНК/белок спермы лосося G AgaorseEMD Millipore16-201
SDSFisher ScientificBP166-500
Tris-ClSigma-AldrichT5941
Triton X-100Acros Organics327372500
Anti-K36me3Abcamab9050
Anti-STAT1Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-345X
Анти-РНК полимераза IISanta Cruz Biotechnology, Inc.СК-899

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levy, D., Darnell, J. E. Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).
  2. Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr The role of STATs in transcriptional control and their impact on ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chromatin ImmunoprecipitationHistone ModificationSTAT SignalingGene Expression AnalysisCross linking ProcedureSonication EfficiencyAntibody PrecipitationDNA PurificationQuantitative PCRInput Sample Control

Related Articles