Summary
Langendorff-mode geïsoleerde perfusie hart, in combinatie met
Abstract
Bioengineered muismodellen zijn geworden krachtige research tools bij het bepalen van causale verbanden tussen moleculaire veranderingen en modellen van hart-en vaatziekten. Hoewel de moleculaire biologie is nodig bij het identificeren van de belangrijkste veranderingen in de signaleringsroute, is het niet een surrogaat voor functionele betekenis. Terwijl de fysiologie kan antwoorden op de vraag van de functie, een combinatie van fysiologie met biochemische evaluatie van metabolieten in het intacte, kloppend hart zorgt voor een compleet beeld van de hartfunctie en energetica. Al jaren is ons laboratorium gebruikt worden geïsoleerd hart perfusie in combinatie met nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie om deze taak te volbrengen. De linker ventrikel functie wordt beoordeeld door Langendorff-mode geïsoleerde hart perfusies terwijl hart-energetica wordt gemeten door het uitvoeren van
Protocol
- Voor deze experimenten zijn twee aparte systemen tegelijk gebruikt. Voor de aankoop van 31 P spectra, een Bruker 14T magneet is gekoppeld aan de Avance III console en een computer uitgerust met TopSpin V2.1 software. Voor de beoordeling van de hartfunctie, een custom built hart perfusie-systeem is gekoppeld aan de PowerLab 4 / 30 data-acquisitie, uitgerust met de LabChartPro 6-software voor data-analyse.
- Op de dag van het experiment, is 1 liter van de Krebs-Henseleit buffer als volgt bereid: 0.5mm EDTA, 5.3mm KCl, 1,2 mm MgSO 4, 118mm NaCl, en 25mm NaHCO 3. Het mengsel wordt vervolgens borrelen met 5% CO 2 / 95% O 2 gedurende 10-15 minuten voorafgaand aan de toevoeging van 2 mM CaCl 2. Tot slot, substraten, in de vorm van 10 mM glucose en 0,5 mm pyruvaat, worden toegevoegd.
- Temperatuurregeling tijdens het experiment is van cruciaal belang. Verwarmde circulatiepompen worden gebruikt om de temperatuur tussen 37,0 onderhouden - 37,5 ° C, terwijl het hart is in de magneet. Temperatuur is gecontroleerd voor de duur van het experiment met behulp van een glasvezel temperatuursonde.
- Perfusiedruk en linker ventriculaire druk worden bewaakt via de druk transducers gekoppeld aan een data-acquisitiesysteem en weergegeven met behulp van de meegeleverde software. Deze worden gekalibreerd met een standaard sfygmomanometer voorafgaand aan het experiment. Daarnaast worden de druk lijnen voldoende gespoeld om alle luchtbellen te verwijderen.
- Een standaard steekproef van 150 mM natriumfosfaat (wat gelijk is aan de ionische sterkte van de KH buffer) wordt gebruikt om "kalibreren" de sonde voor het inbrengen van het hart. Dit vergemakkelijkt het signaal en vermindert de tijd die nodig is om de overname periode begint zodra het hart is gepositioneerd binnen de sonde.
- Ter vermindering van bloedstolling, is de muis geïnjecteerd met 200 eenheden van heparine IP Na 5 minuten, natriumpentobarbital (175 mg / kg) IP wordt gegeven.
- Het hart wordt snel geëxcideerd (met longen en thymus intact) en gearresteerd in ijskoud KH buffer.
- Terwijl op ijs bewaard, zijn de longen snel verwijderd. De lobben van de thymus worden geïdentificeerd en voorzichtig terug geschild naar de aorta bloot te leggen. De thymus is verwijderd. De aorta wordt vervolgens geïsoleerd door het zorgvuldig verwijderen van het omringende weefsel.
- Micro hechten pincet gebruikt worden om voorzichtig te houden beide wanden van de aorta naar het lumen bloot te leggen. De aorta is zorgvuldig geplaatst op de canule gemaakt van 0.965 mm OD polyethyleen buis (PE50). De aorta is op zijn plaats gehouden met een micro-schip klem terwijl de hechtingen worden snel gebonden rond de aorta. De clip is verwijderd en de tang worden gebruikt om zorgvuldig te controleren of de canule boven aortawortel. Extra banden zijn toegevoegd als nodig is om het hart zijn plaats te houden.
- Eventuele extra weefsel wordt verwijderd met behulp van pincet en microscissors. Een kleine incisie gemaakt in de linker oorschelp. Een 0.61 mm OD polyethyleen buis (PE10) is zorgvuldig ingebracht via het linker atrium, LV holte, en via de apex, terwijl zachtjes houdt het hart. Het teveel aan slangen is bijgesneden.
- Een leeggelopen met water gevulde ballon is ingebracht door het atrium in de LV en is op zijn plaats gehouden met behulp van plakband of hechtingen. De peristaltische pomp snelheid wordt geleidelijk verhoogd om voldoende stroom te leveren aan het hart. Tot het hart is plaats in het de NMR probe, zal het hart blijven geperfuseerd met een constante stroom overeenkomt met ongeveer 2 ml / min. De LV ballon wordt opgeblazen met een klein volume met behulp van een micrometer spuit om te controleren of de LV drukomzetter functioneert.
- Het hart wordt zorgvuldig ingebracht in een 10 mm NMR-buis. Een brede boring "spinner" wordt gebruikt om de buis in de juiste positie binnen de sonde gids. Het gehele apparaat is dan stevig aan de 'navelstreng' met plakband.
- De navelstreng wordt langzaam zakken in de bovenste boring van magneet tot het hart / NMR-buis in de spoel van de 10 mm NMR probe.
- Zodra het hart op de juiste positie binnen de sonde, is de peristaltische pomp debiet aangepast om een perfusie druk van 80mmHg te bereiken. (Vergeet niet, dat tot op dit punt het hart was geperfuseerd met een constante stroom van ongeveer 2 ml / min). De perfusie druk wordt dan onderhouden door waardoor de "hold"-mechanisme op de pomp controller. Het hart is dan mag een 15-20 minuten evenwicht periode. Gedurende die tijd, is het volume van de LV ballon aangepast aan een eind-diastolische druk van 8-10 mmHg te bereiken.
- Gedurende de periode van evenwicht, is het noodzakelijk om de spectrometer parameters te optimaliseren om de best mogelijke fosfor-signaal te krijgen. Dit wordt bereikt door het instellen van de radio puls op de frequentie waarop de fosfor kern resoneert ("tuning") en het maken van het magnetisch veld homogeen ("shimming").
- Na de periode van evenwicht, kunnen meerdere 31 P NMR-spectra worden verkregen. De overname periode voor elk spectrum is afhankelijk van de tHij veldsterkte van de magneet, de grootte van de steekproef, en de signaal-ruis-verhouding die nodig is voor een specifiek experiment. Spectra zijn verkregen met behulp van een 14 Telsa magneet door het gemiddelde van het signaal verkregen uit 256 radio-frequentie pulsen van 20 us met een 60 graden hoek van flip en vertraging van 2,0 seconden. Dit experiment zal ongeveer 10 minuten.
Representatieve resultaten
Uit de data-acquisitie hardware en de LabChart software kunnen verschillende parameters van de hartfunctie gemeten worden door de experimentele protocol. De typische meten van de hartfunctie, is de linker ventrikel ontwikkelde druk (LVDevP), wordt verkregen door de eind-diastolische druk (EDP) van de systolische druk (figuur 1). Deze maatregel kan variëren, afhankelijk van de stam van de muis en de conditie van het hart (dat wil zeggen, druk overbelasting). Echter, in een normale muis C57Bl6 hart LVDevP is meestal tussen de 100-110 mmHg op vaste eind-diastolische druk van 8-10 mmHg. Daarnaast heeft de LabChart programma staat voor het meten van de hartslag op basis van de cyclische metingen van de LV drukgolven. Nogmaals, kan deze maatregel variëren, maar typische waarden zijn 350 tot 400 slagen per minuut wanneer harten mogen verslaan op intrinsieke tarieven. Toch kan het hart worden gestandaardiseerd aan de hand een stimulatiesysteem waarbij de hartslag wordt gehouden op 420 bpm. Daarnaast kunnen maatregelen van de contractiliteit (+ dP / dt) en ontspanning (-dP/dt) worden geschat met behulp van de eerste afgeleide van de LV drukgolf. Tijdens de experimentele protocol is het gemakkelijk om de Starling mechanisme te beoordelen door het opnemen van een druk-volume relatie. Dit wordt bereikt door het maken van een geleidelijke verhoging van de LV ballon volume en wijzend op de LVDevP als de EDP. Deze waarden kunnen vervolgens worden uitgezet als afgebeeld in figuur 2. Terwijl de Starling curve is optimaal, wijzend op de volume nodig is om een EDP van 8-10 mmHg te bereiken kan een indirecte idee van LV kamer dimensie te geven. Dit kan gebruikt worden in modellen van aorta strepen als hypertrofisch hart doorgaans zal een kleinere ballon volume nodig hebben, terwijl verwijd hart vereisen een groter volume in vergelijking met controles. Tabel 1 toont vertegenwoordiger van de hartfunctie gegevens die tijdens de perfusie-protocol.
De 31 P NMR-spectrometer zal signalen van phosphocreatine (PCR) en de drie fosfaat uit ATP (γ-ATP, α-ATP en β-ATP) als anorganisch fosfaat (Pi), zoals weergegeven in figuur 2. Analyse van elk van deze pieken geeft een waarde voor het gebied onder de curve. De hoeveelheid ATP wordt geschat door het gemiddelde van de γ-ATP en β-ATP gebieden. (De α-ATP is niet gebruikt omdat NAD moleculen bijdragen aan een onbekende deel van de totale signaal). De energetische toestand van het hart wordt bepaald door het quotiënt van de PCR-en ATP-gebieden (PCR: ATP ratio). Deze waarde is meestal 1,5 tot 1,7 in een muis hart geleverd met glucose als primaire substraat. Hoewel de 31 P-NMR biedt geen directe maatregelen van de ATP-of PCR-, de oppervlakte van de pieken is evenredig met het bedrag van de fosfor bevattende verbindingen in het monster. Waarden voor deze signalen kunnen worden geschat met behulp van andere methoden. Zo kunnen bijvoorbeeld de directe maatregelen van de ATP door high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) in een cohort van harten leveren een gemiddelde concentratie. Deze waarde kan dan worden gebruikt om de gemiddelde ATP gebieden waargenomen in de spectra te kalibreren. De PCR-concentratie kan worden berekend op basis van de PCR-gebied ten opzichte van het ATP-gebied. Het is ook mogelijk om de pH schatten door het analyseren van de relatieve chemische verschuiving van het anorganisch fosfaat (Pi) signaal naar de PCR-signaal. 1 Met behulp van verschillende radio-puls sequenties, de creatine kinase reactie snelheid of de ATP-synthese reactie snelheid kan ook worden gemeten. 2
Tabel 1. Baseline hartfunctie van geïsoleerde doorbloed hart. LVDevP: linker ventrikel ontwikkeld druk; LVEDP: linker ventrikel eind-diastolische druk; HR: de hartslag, RPP: rate pressure product; + dP / dt: eerste afgeleide LV druk positief; -dP/dt: eerste afgeleide LV druk negatief; PP : perfusiedruk; CF: coronaire flow.
Figuur 1. Vertegenwoordiger LV drukgolven van LabChart Pro-software.
Figuur 2. Vertegenwoordiger Starling curven van de controle (vaste lijn) en aorta gestreepte (stippellijn) muizen. A) systolische functie vertegenwoordigd door LVDevP meer dan verhogen LV volumes, zoals bepaald door het volume van de LV ballon. B) diastolische functie vertegenwoordigd door EDP meer dan verhogen LV volumes, zoals bepaald door het volume van de LV ballon. LVDevP: linker ventrikel ontwikkeld druk (systolische minus diastolische pressure), EDP: eind-diastolische druk.
Figuur 3. Vertegenwoordiger van 31 P-NMR-spectra van geïsoleerde geperfuseerd muis hart. Let op de relatief kleine Pi piek. In een aëroob perfusie hart geleverd met pyruvaat of vetzuren in aanvulling op glucose, moet deze piek minimaal zijn. Tijdens perioden van ischemie, deze piek toe, terwijl de PCR-top af. Let op de schouder aan de rechterkant van de α-ATP piek. Dit is de bijdrage van NAD moleculen. Pi: anorganisch fosfaat; PCR: phosphocreatine; ATP: adenosine trifosfaat.
Discussion
31 P-NMR-spectroscopie in de Langendorff-geperfuseerde geïsoleerde muis hart biedt betrouwbare en reproduceerbare gegevens. 3, 4 Echter, het noodzakelijk is dat canulatie van de aorta en het inbrengen van de LV ballon klaar bent goed zoals om een stabiele prestaties van hart toe, terwijl binnen in de NMR buis. Daarnaast, temperatuurregeling van het grootste belang om een goede baseline functie te bereiken. Een belangrijke factor bij het verkrijgen van een goede, analyseerbaar NMR-spectra is het verhogen van de signaal-ruisverhouding. Dit kan worden bereikt door te zorgen voor een optimale "tuning" en "vulplaten" op het monster. Zoals vermeld in het protocol tekst, kan het gebruik van een standaard monster voorafgaand aan het inbrengen van het hart vergemakkelijken. Het is ook nuttig om te beschikken over een adequaat sized "monster". Harten van minder dan 100 mg leveren in de regel lager PCr en ATP-signalen, neemt in de acquisitie tijd zal nodig zijn om een goede fosfor spectra te verkrijgen.
Er zijn verschillende manieren om het bestaande protocol te wijzigen om aanvullende informatie over de hartfunctie en energetica Garner. In ons laboratorium hebben we perfusie harten met gemengde substraat buffers die de aanwezigheid van verschillende combinaties van vetzuren (in lage en hoge concentraties), lactaat, ketonen, en insuline kunnen bevatten. Met het gebruik van stabiele isotopen in de perfusie buffer (dat wil zeggen, 13 C gelabelde substraten), hebben we de mogelijkheid om substraatgebruik schatting van de relatieve bijdrage van gelabelde acetyl CoA naar de TCA cyclus bezitten. 5-7 Voor deze toepassing, voeren we isotopomeer analyse van de 13-C3 en C4 13-glutamaat met 13 C-NMR-spectroscopie. Dit vereist het hart aan het einde van de perfusie protocol freeze-klemmen en het uitvoeren van een extractie van het bevroren weefsel. Dit zal een extra experiment als de analyse van het gebruik van een andere sonde met een apart setup-parameters nodig zijn. Andere toepassingen zijn onder meer de vervanging van glucose met deoxyglucose in de buffer, terwijl het toezicht op de tijdsafhankelijke accumulatie van 2-deoxyglucose fosfaat in het hart met behulp van 31 P-NMR-spectroscopie. Deze methode maakt het mogelijk voor het meten van myocard de opname van glucose. 7, 8 Daarnaast is ons laboratorium heeft geanalyseerd hartfunctie en energetica in perfusie protocollen die bestaat uit ischemie / reperfusie en hoge werkdruk uitdaging. 6, 8-10
In het kort, 31 P-NMR-spectroscopie in geïsoleerde muis harten is een technisch uitdagend procedure waarbij het gebruik van geavanceerde apparatuur. Echter, de gegevens die het oplevert is van onschatbare waarde voor de onderzoeker die wil analyseren de functie en de energetica van bioengineered muismodellen. Voor ons laboratorium, zijn deze technieken zijn van vitaal belang in ons begrip van de gevolgen van een verscheidenheid van stressoren op de hartfunctie, energetica, en de stofwisseling. 1, 11, 12
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Lynne Spencer bedanken voor haar steun tijdens de NMR-spectroscopie deel van het experiment. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health fonds R01 HL059246, R01 HL067970, R01 HL088634 (aan Dr Tian) en F32 HL096284 (aan Dr Kolwicz).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Magnesium Sulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| EDTA | Reagent | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Potassium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | P4505 | |
| Sodium bicarbonate | Reagent | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Sodium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Calcium chloride dihydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| D-Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Sodium Pyruvate | Reagent | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Bruker Ultrashield 600WB Plus | Equipment | Bruker Corporation | ||
| PowerLab 4/30 | Equipment |  ADInstruments |
ML866/P | |
| LabChart 6 Pro | Equipment | ADInstruments |
MLS260/6 | |
| Quad Bridge Amp | Equipment | ADInstruments |
ML224 | |
| STH Pump Controller | Equipment | ADInstruments |
ML175 | |
| Minipuls 3 Peristaltic Pump | Equipment | ADInstruments |
ML172 | |
| Disposable BP Transducer | Equipment | ADInstruments |
MLT0699 | |
| 10mm NMR Sample Tube | Equipment | Wilmad LabGlass | 513-7PP-7 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Equipment | BD Biosciences | 427401 | |
| Physiological Pressure Transducer | Equipment | ADInstruments |
MLT844 | |
| Polyethylene tubing PE50 | Equipment | BD Biosciences | 427411 | |
| Micrometer syringe | Equipment | Gilmont Instruments | GS-1101 | |
| McPherson Forceps | Equipment | Miltex Inc. | 18-949 | |
| Castraviejo microscissors | Equipment | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5650 | |
| Neoptix Signal Conditioner | Equipment | Neoptix, Inc. | Reflex - 1 |
References
- Nascimben, L., Ingwall, J. S., Lorell, B. H., Pinz, I., Schultz, V., Tornheim, K., Tian, R. Mechanisms for increased glycolysis in the hypertrophied rat heart. Hypertension. 44, 662-667 (2004).
- Spindler, M., Saupe, K. W., Tian, R., Ahmed, S., Matlib, M. A., Ingwall, J. S. Altered creatine kinase enzyme kinetics in diabetic cardiomyopathy. A(31)P NMR magnetization transfer study of the intact beating rat heart. J Mol Cell Cardiol. 31, 2175-2189 (1999).
- Ingwall, J. S. Phosphorus nuclear magnetic resonance spectroscopy of cardiac and skeletal muscles. Am J Physiol. 242, H729-H744 (1982).
- Ingwall, J. S., Javadpour, M. M., Miao, W. 31P NMR spectroscopy of the mouse heart. Cardiovascular physiology in the genetically engineered. Hoit, B. D., Walsh, R. A. , Kluwer. Boston. 151-163 (2002).
- Luptak, I., Balschi, J. A., Xing, Y., Leone, T. C., Kelly, D. P., Tian, R. Decreased contractile and metabolic reserve in peroxisome proliferator-activated receptor-alpha-null hearts can be rescued by increasing glucose transport and utilization. Circulation. 112, 2339-2346 (2005).
- Yan, J., Young, M. E., Cui, L., Lopaschuk, G. D., Liao, R., Tian, R. Increased glucose uptake and oxidation in mouse hearts prevent high fatty acid oxidation but cause cardiac dysfunction in diet-induced obesity. Circulation. 119, 2818-2828 (2009).
- Luptak, I., Shen, M., He, H., Hirshman, M. F., Musi, N., Goodyear, L. J., Yan, J., Wakimoto, H., Morita, H., Arad, M., Seidman, C. E., Seidman, J. G., Ingwall, J. S., Balschi, J. A., Tian, R. Aberrant activation of AMP-activated protein kinase remodels metabolic network in favor of cardiac glycogen storage. J Clin Invest. 117, 1432-1439 (2007).
- Xing, Y., Musi, N., Fujii, N., Zou, L., Luptak, I., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J., Tian, R. Glucose metabolism and energy homeostasis in mouse hearts overexpressing dominant negative alpha2 subunit of AMP-activated protein kinase. J Biol Chem. 278, 28372-28377 (2003).
- Luptak, I., Yan, J., Cui, L., Jain, M., Liao, R., Tian, R. Long-term effects of increased glucose entry on mouse hearts during normal aging and ischemic stress. Circulation. 116, 901-909 (2007).
- Tian, R., Abel, E. D. Responses of GLUT4-deficient hearts to ischemia underscore the importance of glycolysis. Circulation. 103, 2961-2966 (2001).
- Liao, R., Jain, M., Cui, L., D'Agostino, J., Aiello, F., Luptak, I., Ngoy, S., Mortensen, R. M., Tian, R. Cardiac-specific overexpression of GLUT1 prevents the development of heart failure attributable to pressure overload in mice. Circulation. 106, 2125-2131 (2002).
- Tian, R., Musi, N., D'Agostino, J., Hirshman, M. F., Goodyear, L. J. Increased adenosine monophosphate-activated protein kinase activity in rat hearts with pressure-overload hypertrophy. Circulation. 104, 1664-1669 (2001).
