Axoplasma Isolation von Rat Ischiasnerv

Summary

Wir zeigen, ein Protokoll für Axoplasma Isolierung von adulten Ratten Ischiasnerv auf Dissektion Nervenfaszikel und Inkubation in hypotonischen Medium Myelin Freigabe und lysieren nicht axonaler Strukturen, die durch Extraktion der restlichen Axon-angereichertem Material gefolgt basiert.

Abstract

Isolierung von reinem axonalen Zytoplasma (Axoplasma) von peripheren Nerven ist entscheidend für biochemische Untersuchungen von vielen biologischen Prozessen. In diesem Artikel zeigen wir, und beschreiben Sie ein Protokoll für Axoplasma Isolierung von adulten Ratten Ischiasnerv auf den folgenden Schritten: (1) Zerlegung der Nervenfaszikel und Trennung von Bindegewebe, (2) Inkubation von kurzen Segmenten Nervenfaszikel in hypotonischen Medium Myelin Freigabe und lysieren nicht axonalen Strukturen, und (3) Extraktion der verbleibenden Axon-angereichertem Material. Proteomik und biochemische Charakterisierung dieser Zubereitung hat einen hohen Grad der Anreicherung für axonale Komponenten bestätigt.

Protocol

Dieses Protokoll ermöglicht Axoplasma Isolation mit der Minimierung der Glia-und Gefäßgewebe Kontamination. Die Methode liefert etwa 70-100 ug Gesamt Axoplasma Protein pro 8-10 Wochen alte Wistar-Ratte.

1. Dissect Ischiasnerven

1. Euthanize zwei Ratten durch CO _2-Inhalation durch Genickbruch folgte. Bestätigen Tod durch Palpation wegen fehlender Herzschlag vor Beginn der Dissektion.
2. Swab der Präparation mit 70% Ethanol.
3. Schneiden Sie die Haut, separate Muskeln und isolieren Ischiasnerv mit einer Schere und Pinzette vorsichtig ohne Beschädigung der Blutgefäße. Dissect sowohl Ischiasnerv (ca. 1,5 cm) von jedem Tier und sammeln Sie alle vier Nerven in einer Eppendorf mit 500 ul PBS von 0,2 + Inhibitoren, auf Eis gehalten.
4. Übertragen Sie die Nerven Segmente Plastikschalen mit mindestens 2 mL PBS von 0,2 + Protease-Inhibitoren.
5. Entfernen Sie das Epineurium von den Nerven mit feinen Pinzetten unter dem Binokular Umfang. Trennen Sie die Faszikel sehr sorgfältig, bis sie bedeckt werden und beginnen, auf der Oberfläche der Lösung schwimmen. Dieser Schritt sollte geübt werden, bis sie schnell und präzise durchgeführt werden können (nicht an mehr als 10 Minuten pro Nerv) werden.

2. Inkubation, Waschen und Elution

1. Übertragung getrennt Faszikeln in ein frisches Eppendorf-Röhrchen mit 500 ul PBS 0.2X mit Protease-Inhibitoren für die Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
2. Wash mindestens 3-mal mit 1 mL des gleichen Puffers durch die Übertragung der Faszikel von Eppendorf-Röhrchen zu Eppendorf-Röhrchen und Schütteln für 5 min nach dem Transfer.
3. So entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit legte die Faszikel in eine neue, leere Eppendorf-Röhrchen und übertragen dann die Faszikel, um eine neue Eppendorf-Röhrchen mit 300 ul PBS 1X mit Protease-Inhibitor für die Inkubation für 20-30 min bei RT.
4. Zentrifuge 10 min bei 10.000 xg bei 4 ° C.
5. Nehmen Sie den Überstand und messen Proteinkonzentration. Dies ist Ihr Axoplasma Vorbereitung.

3. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1. Western-Blot-Vergleich Axoplasma durch die manuelle Squeeze-Methode mit Axoplasma Proben isoliert, wie in diesem Protokoll isoliert dargestellt. Beachten Sie die reduzierte Mengen an Albumin und GFAP, was Blut Protein-und Gliazellen Verunreinigungen beziehungsweise. Im Gegensatz dazu ist axonalen Tubulin b3 in dieser Zubereitung angereichert, was auf eine hohe axonale Proteine.

Discussion

Biochemische und Proteom-Analysen haben bestätigt, dass dieses Verfahren Serum und Gliazellen Verschmutzungsgrad ³ reduziert wie zuvor beschriebenen Verfahren zur Isolierung Axoplasma durch mechanische Squeeze ¹ verglichen. Wir haben diese Axoplasma Isolation Protokoll verwendet, um Dynein-basierte retrograde Signalisierung nach Ischiasnerv Verletzung ² zu erforschen, und erwarten, dass es Nutzen in der Erforschung von vielen anderen Prozessen in der Erwachsenenbildung peripheren Nerven, einschließlich Axon-Glia Interaktionen ⁴ haben.

Materials

Male Wistar rats (8-10 weeks old) PBS 0.2X and PBS 1X solutions containing protease inhibitors (Roshe) 2 tablets per 50 ml Eppendorfs for 1.5 ml Sterilized plastic dishes 35 mm Dissecting tools including: scissors and fine forceps Binocular and table light

Antibodies

Mouse anti-GFAP clone G-A-5 was from Sigma (G6171). Rabbit anti-Albumin was from Cedarlane (CLAG5140). Mouse anti-Tubulin β3 and rabbit anti-gERK were from Sigma (T2200 and M5670 respectively).