トキソプラズマ原虫は、組織培養モデルで模倣することができる環境ストレスに応答して嚢胞フォームに変換します。このビデオでは、骨髄由来のマクロファージや線維芽細胞の変化、増殖培地のpHを活性化することにより、嚢胞壁の形成を調べるためのテクニックを示しています。
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この記事について
サマリー
要約
トキソプラズマ原虫は、温血動物の任意の有核細胞に侵入することができる偏性細胞内寄生体である。感染中に、T.原虫は tachyzoiteと呼ばれる高速な複製形態として発信しています。タキゾイトはよく特徴付けされていないシグナル伝達過程でbradyzoiteと呼ばれる成長が遅い被嚢の形に変換する。動物の中で、bradyzoite嚢胞は中枢神経系と筋肉組織で発見し、感染症の慢性期を表しています。 bradyzoitesへの変換は、高pH、またはインターフェロンγ（IFNγ）の添加により培地を用いて、CO 2飢餓による組織培養でシミュレーションを行うことができます。 Bradyzoitesは、レクチンがDolichos biflorus凝集素（DBA）が結合する嚢胞の壁の存在によって特徴付けられる。蛍光標識されたDBAは、低CO 2と高pHの培地にさらされたヒト包皮線維芽細胞（HFFs）で成長させた寄生虫の嚢胞壁を可視化するために使用されます。 BMMsがIFNγとリポ多糖（LPS）で活性化された後、同様に、内に存在する寄生虫は、マウス骨髄由来マクロファージ（BMMs）は、DBAによって検出可能な嚢胞壁が表示されます。このプロトコルは、Tの変換を誘導する方法を紹介します低CO 2とBMMsの活性化と高pHの増殖培地を使用してbradyzoitesに原虫 。宿主細胞は、カバースリップ上で培養タキゾイトに感染し、どちらかのIFNγとLPS（BMMs）の添加により活性化または三日間高pHの増殖培地（HFFs）に公開されます。感染症が完了すると、宿主細胞は、固定透過性、およびブロックされます。嚢胞壁は、蛍光顕微鏡とローダミンのDBAを使用して視覚化されます。
プロトコル
1。ヒト包皮線維芽細胞（HFF）でコーティングされたカバースリップの準備
- 24ウェル組織培養プレートのウェルの底に滅菌円形のガラスのカバースリップを配置。
- コンフルエント150センチメートル2フラスコからHFFsを回収するために、1 × PBSで2回フラスコを洗い、0.025％トリプシン- EDTA 2.5 mlを加える。 ℃で5〜10分間37℃でフラスコをインキュベートする。
- 手のひらに対してフラスコの側面をタップすると、フラスコから細胞を切り離すに役立ちます。細胞がフラスコから放出したら、HFF培地（ダルベッコ改変イーグル培地[DMEM] 10％のFBS、2mMのL -グルタミン、及び1％ペニシリン - ストレプトマイシン）の150mlを追加し、フラスコを洗浄し、収集する培地を使用して細胞。
- カバースリップとウェルあたりの細胞を1 mlを分注する。
- 細胞は37℃、5％CO 2コンフルエントになることができます。
2。 BMC開発のためのL929条件培地（CM）を準備
- L929は、コンフルエントの長い期間の後に刺激因子、マクロファージコロニーを分泌するマウス異数体の線維肉腫細胞株です。この分泌は、細胞培養1のマクロファージにマウスの骨髄細胞を開発するために使用するL929細胞からのC....
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ディスカッション
T.のbradyzoiteの発展のメカニズムは完全には理解されていませんが、分子遺伝学的解析組織培養における原虫のステージの変換には、bradyzoite嚢胞形成2,3,4に関与する遺伝子の発見につながっている。分析はまた、いくつかのbradyzoiteマーカーは活性化マクロファージ5,6の成長を含む他の長引くストレス状態で発現されるという観察につながった。上記の方法ではTを成長させる方法について説明します原虫と誘導開発されたBMCとHFFs両方でDBA正嚢胞壁の構造。これらの結果は、嚢胞の開発経路が異なるストレス刺激によって誘導されることがハイライト。
ので、T.ゴンは、温血動物のホストからのほぼすべての有核細胞に成長できる、多くの細胞型はT.を成長させるために使用することができます。 in vitroでの原虫 。彼らは細胞株を阻害した接触なのでHFFsは、このプロトコルで使用されていた。細胞培養のbradyz.......
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
この作品は、ウィスコンシン大学マディソンハーマンI.シャピロ識別大学院フェローシップ（CMT）、NIHの賞AI072817（AMP）とアメリカ心臓協会賞0840059N（LJK）の大学によってサポートされていました。....
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 牛血清アルブミン (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11960-051 | |
| 胎牛血清 (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | 非動化処理済み |
| ロダミン Dolichos biflorus アグルチニン | Vector Laboratories | RL-1032 | |
| ホルムアルデヒド (16%) | Polysciences, Inc. | 18814 | |
| グリシン | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | |
| IFNγ | PeproTech Inc | 315-05 | 1回分ずつ分注して保存 |
| L-グルタミン (200mM) | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| リポ多糖 (LPS) | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | 1回分ずつ分注して保存 |
| 顕微鏡用カバーガラス | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| RPMI 1640 培地粉末 (L-グルタミン含有、重炭酸塩不含) | GIBCO, by Life Technologies | 31800-022 | |
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| トリプシン-EDTA (0.25%) | GIBCO, by Life Technologies | 25200 | |
| VectaShield DAPI含有封入剤 | Vector Laboratories | H-1200 |
参考文献
- Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).
- Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S.
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再版と許可
