Summary
يرقات ذبابة الفاكهة السوداء البطن توفير نظام النموذج المثالي للتحقيق في آليات النقل داخل محواري الأعصاب قطعي اليرقات. باستخدام هذا الإجراء ، يمكن مقارنة 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة تحمل طفرات مختلفة ليرقات النوع البري.
Abstract
ذبابة الفاكهة السوداء البطن في الظهور كنظام نموذج قوية لدراسة تطوير وظيفة من وظائف الجهاز العصبي ، وخصوصا بسبب الوراثة لها مريحة وتسلسل الجينوم الكامل. بالإضافة إلى ذلك ، فإن النظام العصبي اليرقات هو نظام نموذج مثالي لدراسة آليات النقل محواري كما تحتوي على أعصاب اليرقات قطعي حزم من المحاور مع الهيئات التي تقع داخل الخلية على المخ والأعصاب الطرفية التي تنتهي على طول الجسم. نحن هنا وصف الإجراء لرؤية البروتينات حويصلة متشابك داخل الأعصاب قطعي اليرقات. إذا فعلت بشكل صحيح ، وجميع مكونات الجهاز العصبي ، جنبا إلى جنب مع أنسجة المرتبطة بها مثل العضلات وNMJs ، ما زالت سليمة ، سليمة ، وجاهزة للتصور. يتم تشريح 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة تحمل طفرات مختلفة ، الثابتة ، وحضنت مع الأضداد حويصلة متشابك ، وتصور بالمقارنة مع نوع اليرقات البرية. ويمكن تكييف هذا الإجراء لعدة أجسام مختلفة متشابك أو العصبية والتغيرات في توزيع مجموعة متنوعة من البروتينات يمكن ملاحظتها بسهولة داخل الأعصاب قطعي اليرقات.
Protocol
1. إعداد الكواشف
- إعداد 1X الاحتياطي تشريح باستخدام كلوريد الصوديوم 128 ملم ، 4mM CaCl 2 ، 4mM MgCl 2 ، 2 مم بوكل ، HEPES 5mM والسكروز 36mM. PH 7.2 الحل لتعقيم وتصفية.
- إعداد مثبت باستخدام 01:01 التخفيف من الفورمالديهايد بنسبة 16 ٪ والاحتياطي 1X تشريح.
- إعداد 1X PBT باستخدام الفوسفات 1X التخزين المؤقت المالحة (PBS) في PH من 7.2 و تريتون X - 100 في نسبة 1:100.
- تحضير 5 ٪ مصل الزلال البقري (BSA) مع 0.01 ٪ في برنامج تلفزيوني نا آزيد 1X.
2. التحضير للتشريح
- يتم استخدام أطباق Sylgard لتشريح. إعداد أطباق بصب Sylgard الاستومر سيليكون 184 قاعدة وعلاج خليط عامل في طبق بتري. يسمح هذا المزيج على ترسيخ وجافة تماما قبل استخدامها.
- قبل التشريح ، وجمع الزوج نظيف # 5 ملقط ، زوج مستقيم نظيف شفرة المقص vannas ، والدبابيس.
3. تشريح 3 اليرقات طور مرحلي الثالثة
- جمع اليرقات طور مرحلي يتجول 3 الثالثة من النمط الجيني محددة على طبق بتري.
- غسل اليرقات في الماء منزوع الأيونات للتخلص من المواد الغذائية.
- مكان اليرقة على طبق sylgard ، حتى مع الجانب الظهري. دبوس اليرقة في غاياتها الأمامي والخلفي.
- وضع قطرة من الاحتياطي تشريح 1X على يرقة دبس. باستخدام مقص غرامة ارتشف اليرقة على خط الوسط الظهرية قرب نهاية الخلفي. باستخدام مقص ، قص إهاب اليرقات من نهاية الخلفي حتى النهاية الأمامية.
- وضع قطرة من جديد الاحتياطي تشريح 1X على اليرقة تشريح. باستخدام دبوس ، واختيار واحد من الحافة الجانبية للبشرة بالقرب من وسط اليرقة ويعلقون عليه إهاب. باستخدام آخر دبوس ، دبوس على حافة second الجانبي للبشرة كما هو موضح في الرسم التخطيطي. وتستخدم اثنين من المسامير على كل جانب الوحشي. انظر الرسم البياني أدناه.
- إزالة بعناية للأمعاء ، والهيئات الدهون ، والقصبة الهوائية ، ولم يتبق سوى الدماغ مع فصين اثنين البصرية والعقد البطنية مع الأعصاب قطعي المرفقة. انجاز ما تبقى من النظام الداخلي في صحن sylgard.
4. تثبيت للتشريح اليرقة
- احتضان اليرقة تشريح في الإصلاح لمدة 30 دقيقة ، عن طريق استبدال الإصلاح كل 15 دقيقة.
- بعد التثبيت ، شطف يرقة في PBT 1X لمدة 30 دقيقة عن طريق استبدال العازلة كل 10 دقائق. ومن المهم أن نلاحظ أن اليرقة ينبغي أن يكون دائما في المخزن.
5. يلطخ الضد من اليرقة تشريح
- إعداد الأجسام المضادة الأولية عن طريق تمييع لتركيز مناسبة في جيش صرب البوسنة 5 ٪ مع آزيد نا في PBT 1X. وسوف تختلف تركيزات الأمثل لأجسام مضادة مختلفة.
- استبدال PBT مشاركة 1X شطف مع الحل الضد الأولية المعدة واحتضان في حجرة رطبة عند 4 درجات مئوية خلال الليل. هي التي شيدت من قبل الغرفة الرطبة المبطنة طبق من البلاستيك مع كيم مناديل المنقوعة في الماء.
- في اليوم التالي ، شطف يرقة في تشريح PBT 1X لمدة 30 دقيقة عن طريق استبدال العازلة كل 10 دقائق.
- إعداد الأجسام المضادة الثانوية إلى تمييع التركيز المناسب في جيش صرب البوسنة 5 ٪ مع آزيد نا في PBT 1X ، واحتضان اليرقة مع الحل القائم على الأجسام المضادة الثانوية في 25 درجة مئوية لمدة ساعة. التفاف الغرفة الرطبة في احباط لمنع الخفيفة ، والأجسام المضادة الثانوية خفيفة حساسة.
- بعد الحضانة ، شطف يرقة في PBT 1X لمدة 30 دقيقة عن طريق استبدال العازلة كل 10 دقائق.
6. تصاعد والتخيل للتشريح اليرقة
- قبل التركيب اليرقة على الشريحة ، وإعداد الشريحة من خلال نشر سطرين العمودي طلاء الأظافر في الوسط ، مع مساحة كافية لتغطية زلة على الجلوس على (انظر الرسم البياني). السماح للطلاء الأظافر جافة تماما.
- وضع قطرة العازلة تصاعد في الفضاء بين خطوط عمودية تلميع الأظافر على الشريحة (انظر الرسم البياني). الشريحة الآن جاهزة للتركيب.
- بعد شطف مشاركة 1X PBT ، إزالة بلطف دبابيس الجانبية. كن حذرا حتى لا تمزق بشرة.
- إزالة المسامير بعناية المتبقيتين والتقاط اليرقة مع ملقط ومكان اليرقة أفقيا على الشريحة المعدة. تأكد من عدم اليرقة انقلبت والجانب البطني المنحى يصل.
- المكان بلطف زلة غطاء على رأس وختم حواف مع طلاء الأظافر (انظر الرسم البياني). اليرقة هي الآن جاهزة للتصوير تحت المجهر الفلورسنت.
7. ممثل النتائج
الشكل 1 : صورة ممثل الأعصاب قطعي اليرقات من نوع larv البريةa باستخدام أجسام مضادة ضد بروتين حويصلة متشابك بروتين سلسلة السيستين (CSP ، Zinsmaier آخرون 1994). علما بأن الأعصاب قطعي ملطخة بسلاسة. = شريط 20μm
الشكل 2 : صورة ممثل الأعصاب قطعي اليرقات من البروتين السيارات الطافرة اليرقة باستخدام أجسام مضادة ضد بروتين حويصلة متشابك بروتين سلسلة السيستين (CSP). علما بأن الأعصاب قطعي التراكمات الهائلة التي تظهر بقع براقة لCSP (الأسهم).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويرقات ذبابة الفاكهة الأعصاب قطعي وجود نظام قوي لدراسة آليات النقل في محواري. إذا أجري تشريح الثالثة 3 اليرقات طور مرحلي بشكل صحيح ، يمكن النظر في جميع مكونات الجهاز العصبي المركزي ، الجهاز العصبي المحيطي ، والأنسجة المرتبطة بها ، مثل العضلات وNMJs ، داخل يرقة واحدة. وقد تكيفت نحن من هذا البروتوكول واحدة نشرتها هيرد وساكستون (1996). ويمكن أيضا هذا البروتوكول يمكن تكييفها لاختبار الأجسام المضادة الخلايا العصبية الأخرى ، ولكن ينبغي أن يتم الاستفادة المثلى من الأجسام المضادة. يمكن تغيير الحضانة الضد الابتدائي والثانوي مرات أو يمكن إضافة خطوة الحجب. وقد استخدمنا بنجاح هذا البروتوكول للتحقيق في دور بروتين اميلويد السلائف 1 و 2 في مجال النقل Huntingtin محواري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويؤيد الأمين العام بأموال من جامعة ولاية نيويورك في بوفالو من مؤسسة جون وOishei ر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Minutien Pins, Stainless Steel | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Mcpherson-Vannas Straight Blade 8cm Scissors | Fisher Scientific | 50822236 | |
| Vectashield, Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer | Dow Corning | 4026148 | |
| formaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| dCSP3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 |
References
- Gunawardena, S., Goldstein, L. Disruption of Axonal Transport and Neuronal Viability by Amyoid Precursor Protein Mutations in Drosophila. Neuron. 32 (2), 389-401 (2001).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40 (1), 1-2 (2003).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144 (3), 1075-1085 (1996).
- Zinsmaier, K. E., Eberle, K. K., Buchner, E., Walter, N., Benzer, S. Paralysis and early death in cysteine string protein mutants of Drosophila. Science. 263, 977-980 (1994).
