In questo protocollo dimostriamo l'espressione, solubilizzazione e la purificazione di una proteina di membrana ricombinanti espresse, MexB, come un complesso proteina solubile detergente. MexB è un trasportatore di membrana multifarmaco resistenza da parte degli agenti patogeni opportunistici batterici Pseudomonas aeruginosa.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Espressione, solubilizzazione detergente, e purificazione di un trasportatore di membrana, la proteina multiresistente MexB Resistenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
Multiresistenza ai farmaci (MDR), la capacità di una cellula tumorale o patogeno per resistere ad una vasta gamma di strutturalmente e funzionalmente correlati farmaci anti-cancro o antibiotici, è un grave problema attuale della salute pubblica. Questa resistenza ai farmaci è in gran parte a causa di pompe per la somministrazione di energia-dipendente efflusso. Le pompe espellere farmaci anti-cancro o antibiotici nel mezzo esterno, riducendo la loro concentrazione intracellulare di sotto di una soglia di tossicità. Stiamo studiando la resistenza ai farmaci in Pseudomonas aeruginosa, un patogeno opportunistico che provoca infezioni batteriche nei pazienti con molti tipi di lesioni o malattie, per esempio, ustioni o fibrosi cistica, e anche in immuno-cancro, dialisi, trapianto e pazienti. Le principali pompe di efflusso MDR in P. aeruginosa sono complessi tripartita composta da una membrana interna protone-droga antiporter (RND), un canale di membrana esterna (OMF), e una proteina linker periplasmatico (MFP) 1-8. Le proteine RND e OMF sono proteine transmembrana. Proteine transmembrana rappresentano oltre il 30% di tutte le proteine e il 65% dei bersagli farmacologici in corso. I domini transmembrana idrofobici produrre le proteine solubili in tampone acquoso. Prima di una proteina transmembrana può essere purificato, è necessario trovare le condizioni tampone contenente un detergente delicato che consentono la proteina di essere solubilizzati come un complesso detergente proteico (PDC) 9-11. In questo esempio, usiamo un RND proteine, il P. aeruginosa transmembrana trasportatore MexB, per dimostrare come esprimere una forma ricombinante di una proteina transmembrana, solubilizzare usando detersivi, e poi purificare i complessi proteici detergente. Questo metodo generale può essere applicato l'espressione, la purificazione, e la solubilizzazione di molte altre proteine di membrana ricombinanti espresse. I complessi proteici detergente può essere utilizzato successivamente per la caratterizzazione biochimica e biofisica tra cui X-ray determinazione della struttura cristallina o studi di reticolazione.
Protocollo
1. 1 ° giorno:
MexB da Pseudomonas aeruginosa è codificato da pFB101. Il gene è stato amplificato da MexB P. aeruginosa DNA genomico e inserite nel NdeI e siti di restrizione XhoI del + pET30b vettore. Il costrutto contiene un C-terminale tag hexahistidine.
- Il plasmide viene utilizzato per trasformare E. coli ceppo C43 (DE3) 12, e il trasformanti sono placcati su agar LB contenente 30 ug / ml kanamicina.
2. 2 ° giorno: Pernottamento Culture:
- In serata, 4 X 3 culture LB ml contenente 30 ug / ml kanamicina sono inoculate dalle colonie tr....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Oltre alla resistenza multidrug, molte attività vitali cellulari, compreso il trasporto di ioni, comunicazione cellula-cellula, il trasporto delle vescicole, il mantenimento della struttura cellulare, e interazioni ospite-patogeno, coinvolgono le proteine che sono incorporati nella membrana cellulare. Proteine transmembrana costituiscono oltre il 30% di proteine note e sono gli obiettivi per la maggior parte dei farmaci oggi in uso. Il pieghevole improprio o attività delle proteine transmembrana portare a import.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo progetto è stato sostenuto dalle concessioni per CJJ dalla National Science Foundation e la Società per Scienze Biomolecolari.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tampone campione SDS | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Stirpe di E. coli C43(DE3) | Lucigen | 60345-1 | |
| solfato di kanamicina | Sigma-Aldrich | K4378 | |
| terreno 2XYT | Fisher Scientific | BP2466-2 | |
| terreno LB | Fisher Scientific | AC61189-5000 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| DNasi I | Fisher Scientific | BP3226-1 | |
| lisozima | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| compresse di inibitore di proteasi completo senza EDTA | Roche Group | 11 873 580 001 | |
| NaP monobasico | Sigma-Aldrich | S6566 | |
| NaP dibasico | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Glicerolo | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| n-dodecil-β-D-maltopiranoside | Anatrace | D310 | |
| tubi da 15 ml | Corning | 430052 | |
| Agitatore oscillante (See-Saw Rocker) | Fisher Scientific | SSL 4 | |
| resina per affinità su metallo Talon | Clontech Laboratories | 635503 | |
| imidazolo | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| gel SDS-PAGE al 10% di poliacrilamide | Bio-Rad | 161-1454 | |
| tampone di corsa Tris/glicina/SDS-PAGE | Bio-Rad | 161-0732 | |
| marcatori di peso molecolare precolorati Kaleidascope | Bio-Rad | 161-0324 | |
| colonna Superose 12 30/10 | GE Healthcare | 12 10/300 GL | |
| concentratore centrifugo Amicon | EMD Millipore | UFC801024 | |
| filtrino per siringa | Fisher Scientific | SLFG R04 NL | |
| flaconi di Fernbach | Fisher Scientific | 09-552-39 | |
| agitatore per flaconi di Fernbach | Fisher Scientific | ||
| sistema Akta | GE Healthcare | ||
| centrifuga su larga scala J6 con rotore JLA-8.1000 | Beckman Coulter Inc. | ||
| bottiglie da centrifuga da 1 l | Beckman Coulter Inc. | 969329 | |
| centrifuga RC-5 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| rotore fisso SS34 e tubi | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| ultracentrifuga da pavimento Sorvall | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| rotore T647.5 e tubi con tappi | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08322 | |
| French Pressure Cell | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 |
Riferimenti
- Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space. J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).
- Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
