В этом протоколе мы демонстрируем выражения, солюбилизации и очистки рекомбинантно выразил мембранный белок, MexB, как растворимый комплекс моющих средств белка. MexB является множественной лекарственной транспортер сопротивление мембраны от оппортунистических бактериальных патогенов синегнойной палочкой.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выражение, детергентов солюбилизации и очистки Мембранные Transporter, сопротивление MexB множественной лекарственной белка
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ), способность раковых клеток или возбудителя устойчивы к широкому кругу структурно и функционально не связанных противораковых препаратов или антибиотиков, в настоящее время является серьезной проблемой в области общественного здравоохранения. Это множественная лекарственная устойчивость во многом объясняется энергозависимых насосов наркотиков истечения. Насосы изгнать противораковых препаратов или антибиотиков во внешнюю среду, снижая их внутриклеточной концентрации ниже токсичного порога. Мы изучаем множественной лекарственной устойчивостью в синегнойной палочки, оппортунистических бактериальный возбудитель, который вызывает инфекции у больных со многими типами травмы или болезни, например, ожогов или кистозный фиброз, а также в с ослабленным иммунитетом рака, диализа и трансплантации пациентам. Основные MDR откачивающих в P. палочки являются трехсторонние комплексы состоят из внутренней оболочки протона с наркотиками антипортера (РНД), внешний канал мембраны (OMF), а периплазматического белка компоновщика (МФУ) 1-8. РНД и OMF белки трансмембранных белков. Трансмембранных белков составляют более 30% всех белков и 65% от текущей лекарственных препаратов. Гидрофобных трансмембранных доменов делают белки нерастворимы в водном буфере. Перед трансмембранный белок может быть очищена, необходимо найти буфера условиях, содержащих мягкого моющего средства, которые позволяют белка в раствор, как белковый комплекс моющих средств (PDC) 9-11. В этом примере мы используем RND белка, П. палочки MexB трансмембранного транспортер, чтобы продемонстрировать, как выразить рекомбинантная форма трансмембранного белка, растворить его, используя моющие средства, а затем очистить белковых комплексов моющего средства. Этот общий метод может быть применен к выражению, очистка и солюбилизации многих других рекомбинантно выразил мембранных белков. Белковых комплексов моющего средства в дальнейшем могут быть использованы для биохимических и биофизических характеристик в том числе рентгеноструктурного определения структуры или сшивания исследований.
Протокол
1. День 1:
MexB с синегнойной палочкой кодируется pFB101. Ген MexB усиливался из P. палочки геномной ДНК и вставляют в NdeI и XhoI ограничение сайты pET30b векторных. Построить содержит С-концевой hexahistidine тега.
- Плазмиды используется для преобразования Е. палочки штамма C43 (DE3) 12, и трансформанты высевают на LB агар, содержащий 30 мкг / мл канамицина.
2. День 2: Ночь культуры:
- Вечером, 4 х 3 мл LB культур, содержащих 30 мкг / мл канамицина засевают из свежих колоний трансформантов. Кроме того, культуры могут быть прививки от за....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В дополнение к лекарственной устойчивости, многие жизненно важные клеточной активности, в том числе транспорт ионов, межклеточной коммуникации, транспорт везикул, поддержание клеточной структуры, а хозяин-патоген взаимодействия, связаны с белками, которые встраиваются в клеточные мембраны. Трансмембранных белков составляют более 30% известных белков и являются целью для большинства фармацевтических препаратов, используемых сегодня. Неправильное складывание или активность трансмембранных белков приводят к важным генетиче.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Этот проект был поддержан грантами для CJJ от Национального научного фонда и Общества биомолекулярных наук.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Буфер для подготовки образцов с SDS | Bio-Rad | 161-0737 | |
| штамм E. coli C43(DE3) | Lucigen | 60345-1 | |
| канамицинсульфат | Sigma-Aldrich | K4378 | |
| среда 2XYT | Fisher Scientific | BP2466-2 | |
| среда LB | Fisher Scientific | AC61189-5000 | |
| ИПТГ | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| ДНКаза I | Fisher Scientific | BP3226-1 | |
| Лизоцим | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Готовые таблетки с ингибиторами протеаз без ЭДТА | Группа Roche | 11 873 580 001 | |
| однозамещенный фосфат натрия | Sigma-Aldrich | S6566 | |
| дигидрофосфат натрия | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S6191 | |
| MgCl₂2 | Sigma-Aldrich | M1028 | |
| Глицерин | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| <электронная микроскопия>n-додецил-β-D-мальтопиранозид | Anatrace | D310 | |
| пробирки объемом 15 мл | Corning | 430052 | |
| Качалка-балансир | Fisher Scientific | SSL 4 | |
| Металлоаффинная смола Talon | Clontech Laboratories | 635503 | |
| имидазол | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| 10% полиакриламидные гели для SDS-PAGE | Bio-Rad | 161-1454 | |
| Рабочий буфер для электрофореза в ПААГ с Трис/глицином/SDS | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Преокрашенные маркеры молекулярной массы Kaleidascope | Bio-Rad | 161-0324 | |
| колонка Superose 12 30/10 | GE Healthcare | 12 10/300 GL | |
| Центрифужный концентратор Amicon | EMD Millipore | UFC801024 | |
| Шприцевой фильтр | Fisher Scientific | SLFG R04 NL | |
| Колбы Фернбаха | Fisher Scientific | 09-552-39 | |
| Шейкер для колб Фернбаха | Fisher Scientific | ||
| Система Akta | GE Healthcare | ||
| Центрифуга J6 большой вместимости с ротором JLA-8.1000 | Beckman Coulter Inc. | ||
| центрифужные стаканы объемом 1 л | Beckman Coulter Inc. | 969329 | |
| центрифуга RC-5 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Ротор с фиксированным углом SS34 и пробирки | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Напольная ультрацентрифуга Sorvall | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Ротор T647.5 и пробирки с крышками | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 08322 | |
| Французская камера высокого давления | Thermo Fisher Scientific, Inc. | FA-032 |
Ссылки
- Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space. J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).
- Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
