Expresión, la solubilización de detergente, y purificación de un transportador de membrana, la proteína de resistencia a múltiples fármacos MexB

Resumen

En este protocolo se demuestra la expresión, solubilización y purificación de una proteína de membrana recombinante expresado, MexB, como un complejo de proteínas solubles en detergente. MexB es un transportador de membrana de resistencia a múltiples fármacos de la bacteria patógena oportunista Pseudomonas aeruginosa.

Resumen

Resistencia a múltiples fármacos (MDR), la capacidad de una célula cancerosa o patógenos resistentes a un amplio rango de vista estructural y funcionalmente relacionadas fármacos contra el cáncer o los antibióticos, es un problema actual grave en la salud pública. Esta resistencia a múltiples fármacos se debe principalmente a la energía que dependen de las bombas de eflujo de drogas. Las bombas de expulsión de fármacos contra el cáncer o los antibióticos en el medio externo, la reducción de su concentración intracelular por debajo de un umbral tóxico. Estamos estudiando la resistencia a múltiples en Pseudomonas aeruginosa, un patógeno oportunista bacteriana que causa infecciones en pacientes con muchos tipos de lesiones o enfermedad, por ejemplo, quemaduras o la fibrosis quística, y también en personas inmunodeprimidas cáncer, diálisis y trasplante de los pacientes. El principal flujo de salida de las bombas MDR en P. aeruginosa son complejos tripartito formado por una membrana interna de protones antiporter drogas (RND), un canal de membrana externa (OMF), y una proteína de enlazador periplasmic (MFP) ^1-8. Las proteínas RND y OMF son proteínas transmembrana. Proteínas transmembrana representan más del 30% de todas las proteínas y son un 65% de los objetivos actuales de drogas. Los dominios transmembrana hidrofóbica que las proteínas insolubles en tampón acuoso. Antes de que una proteína transmembrana puede ser purificado, es necesario encontrar las condiciones de tampón que contiene un detergente suave que permite que la proteína se solubiliza como un complejo de proteínas de detergente (PDC) ^11.09. En este ejemplo, se utiliza una proteína RND, el P. MexB aeruginosa transportador transmembrana, para demostrar la manera de expresar una forma recombinante de una proteína transmembrana, que solubilizan el uso de detergentes, y luego purificar los complejos de proteínas de detergente. Este método general se puede aplicar a la expresión, purificación, y la disolución de muchas otras proteínas de membrana recombinantes expresadas. Los complejos de detergente proteína pueda ser utilizado posteriormente para la caracterización bioquímica y biofísica incluyendo rayos X de la determinación de la estructura cristalina o estudios de entrecruzamiento.

Protocolo

1. Día 1:

MexB de Pseudomonas aeruginosa es codificada por pFB101. El gen se amplificó a partir MexB P. aeruginosa ADN genómico y se inserta en el NdeI y XhoI sitios de restricción del vector pET30b +. La construcción contiene una etiqueta hexahistidina C-terminal.

1. El plásmido se utilizó para transformar E. coli cepa C43 (DE3) ^12, y los transformantes se sembraron en agar LB que contenían 30 ug / ml de kanamicina.

2. Día 2: cultivos de una noche:

2. Por la noche, 4 x 3 culturas LB ml que contienen 30 ug / ml kanamicina se inoculan de las ....

Discusión

Además de la resistencia a múltiples fármacos, muchas de las actividades celulares vitales, incluyendo el transporte de iones, la comunicación celular, el transporte de vesículas, el mantenimiento de la estructura celular, y las interacciones huésped-patógeno, involucrar a las proteínas que se incrustan en la membrana celular. Proteínas transmembrana representan más del 30% de proteínas conocidas y son el objetivo de la mayoría de los fármacos actualmente en uso. El plegado inapropiada y la actividad de las proteínas tr.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tampón muestral SDS	Bio-Rad	161-0737
Cepa de E. coli C43(DE3)	Lucigen	60345-1
Sulfato de kanamicina	Sigma-Aldrich	K4378
Medio 2XYT	Fisher Scientific	BP2466-2
Medio LB	Fisher Scientific	AC61189-5000
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
DNasa I	Fisher Scientific	BP3226-1
Lisozima	Sigma-Aldrich	L7651
Tabletas de inhibidores de proteasas libres de EDTA Complete	Roche Group	11 873 580 001
NaP monobásico	Sigma-Aldrich	S6566
NaP dibásico	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S6191
MgCl2	Sigma-Aldrich	M1028
Glicerol	Fisher Scientific	BP229-1
n-dodecil-β-D-maltopiranosido	Anatrace	D310
Tubos de 15 ml	Corning	430052
Agitador See-Saw Rocker	Fisher Scientific	SSL 4
Resina de afinidad metálica Talon	Clontech Laboratories	635503
Imidazol	Sigma-Aldrich	I5513
Geles de PAGE-SDS de poliacrilamida al 10 %	Bio-Rad	161-1454
Tampón de corrida Tris/glicina/SDS para PAGE	Bio-Rad	161-0732
Marcadores de peso molecular preteñidos Kaleidascope	Bio-Rad	161-0324
Columna Superose 12 30/10	GE Healthcare	12 10/300 GL
Concentrador centrífugo Amicon	EMD Millipore	UFC801024
Filtro de jeringa	Fisher Scientific	SLFG R04 NL
Matraces Fernbach	Fisher Scientific	09-552-39
Agitador para matraces Fernbach	Fisher Scientific
Sistema Akta	GE Healthcare
Centrífuga a gran escala J6 con rotor JLA-8.1000	Beckman Coulter Inc.
Botellas de centrífuga de 1 l	Beckman Coulter Inc.	969329
Centrífuga RC-5	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Rotor y tubos SS34 de ángulo fijo	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Ultracentrífuga de piso Sorvall	Thermo Fisher Scientific, Inc.
Rotor T647.5 y tubos con tapas	Thermo Fisher Scientific, Inc.	08322
Célula de presión francesa	Thermo Fisher Scientific, Inc.	FA-032