将dsRNA注射入雌性埃及伊蚊成蚊

摘要

反向遗传学方法已被证明在确定蚊子对媒介传播病原体抗性相关基因方面极为有效。本视频协议展示了James实验室采用的一种将dsRNA注射到携带登革热病毒的埃及伊蚊雌蚊中的方法。视频中演示了注射针头的校准、注射装置的操作，以及将dsRNA注入蚊子胸部的技术。

摘要

反向遗传学方法已被证明在确定蚊子对媒介传播病原体抗性相关基因方面极为有效。本视频方案展示了James实验室用于将dsRNA注射到携带登革热病毒的埃及伊蚊雌蚊中的方法。视频中演示了注射针头的校准、注射装置的操作以及将dsRNA注入蚊子胸部的技术。

方案

1. 通过拉制玻璃毛细管来制备显微注射针。我们使用 Sutter Instrument CO 公司的针头拉制仪（型号 P-2000）。针头拉制仪的程序参数设置如下：
   
   heat: 275
   fil: 3
   vel: 37
   del: 250
   pul: 125
   
   
2. 在注射针中吸入已知体积（例如，1 μl）的水，并用细头记号笔手动标记刻度。
3. 为蚊子准备一个注射后放置杯。首先剪去 1000 μl 吸头最前端部分，然后在杯子侧面开一个孔，将吸头剩余部分插入孔中，并在杯口加盖网罩或杯盖。
4. 准备两个装满冰的泡沫塑料箱。将 1 号冰盒置于体视显微镜下，并在冰面上放置一块玻璃表面皿。
5. 用 CO₂ 麻醉成年蚊子，并将装有成蚊的杯子放入 2 号冰盒中。
6. 准备用于注射 dsRNA 的注射针。将装有 dsRNA 的注射针插入注射装置的塑料软管上（注射装置的结构说明见下文）。
7. 用镊子将一只麻醉后的蚊子从杯中转移到表面皿上。用蚊子体壁划破注射针尖以打开针端，随后丢弃这只蚊子。
8. 进行注射时，将注射针插入蚊子的胸部。用另一只手将注射器的阀门从“静止位置”调整至“注射位置”，并推动活塞，直至注入所需量的 dsRNA。
9. 将完成注射的蚊子放入注射后放置杯中。

注射阻断装置的设置

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