בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ניסיוני בטכניקות בשימוש לפברק תואם, תאי המטריצה (ECM) מצעים מצופה מתאים תרבית תאים, ואשר ניתנים במיקרוסקופ כוח המתיחה והתבוננות ההשפעות של קשיחות ECM על התנהגות התא.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
הסדרת הידבקות הסלולר מטריקס תאית (ECM) חיונית נדידת תאים שיפוץ ECM. הידבקויות מרחק הם מכלולים macromolecular כי בני הזוג cytoskeleton כויץ F-אקטין ECM. חיבור זה מאפשר שידור של כוחות מכניים תאיים על פני קרום התא למצע הבסיסי. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח את תכונות מכניות של ECM להסדיר הידבקות מוקד ו-F-אקטין מורפולוגיה, כמו גם תהליכים פיזיולוגיים רבים, כולל התמיינות תאים, חלוקה, הפצה והגירה. לפיכך, השימוש מצעים תרבית תאים הפכה שיטה נפוצה יותר ויותר בדיוק מלאה לווסת ECM תכונות מכניות.
כדי לכמת את כוחות המתיחה על הידבקויות מוקד בתא חסיד, מצעים תואם משמשים בשילוב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה וטכניקות חישוביות בתוך שיטה מיקרוסקופית המכונה כוח המתיחה (TFM). טכניקה זו מתבססת על מדידות של עוצמת הכיוון המקומית של דפורמציות המצע המושרה על ידי התכווצות הסלולר. בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה של החלבונים המתויגים fluorescently, ניתן לתאם ארגון שיפוץ cytoskeletal עם כוחות המתיחה.
כאן אנו מציגים את פרוטוקול הניסוי מפורט להכנת דו מימדי, מטריצות תואם לצורך יצירת מצע תרבית תאים עם קשיחות, מאופיין היטב מכני מתכונן, אשר מתאים למדידת התכווצות הסלולר. פרוטוקולים אלה כוללים ייצור של הידרוג polyacrylamide, ציפוי של חלבונים ECM על ג'ל כזה, תאים ציפוי על ג'לים, ברזולוציה גבוהה מיקרוסקופיה confocal באמצעות תא זלוף. בנוסף, אנו מספקים מדגם מייצג של נתונים הוכחת המיקום ואת העוצמה של הכוחות באמצעות הסלולר מצוטט בפרוטוקולים TFM.
פרוטוקול
1. הפעלת משטח coverslip
- Coverslips (# 1.5, 22x40 מ"מ) מנקים באמצעות סדרה של שוטף סבון אתנול פרוטוקול שתואר קודם לכן (ווטרמן, סטורר, 1998) כדי לנקות ולהסיר את האבק.
- Coverslips מקום מתלה נירוסטה מחזיק, כגון coverslips כי הם מרווחים מזה לא נוגע.
- במנדף כימי קטר (nitrile כפפות ומשקפי מגן מומלץ), לדלל כוח מלא 3-aminopropyltrimethoxysilane ב isopropanol ריכוז סופי של 2% (2ml silane / 100 מ"ל isopropanol) כדי למלא צלחת זכוכית מרובע (~ 350ml נפח). ב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ההליך המתואר כאן להתקנה של מיקרוסקופ כוח המתיחה (TFM) ניסוי, יחד עם יישום שגרת מעקב חישובית (Sabass et al., 2008), מאפשרת כימות של כוחות הסלולר עם רזולוציה מיקרון בקנה מידה מרחביים. כדי לייעל את פרוטוקול הניסוי, חיוני ליצירת מצע ג'ל טהור ואחיד עם ציפוי אחיד של ליגנד ECM. אנו דנים החסרונות האפשריים הבאים:
לא אחידה משטח ג'ל או דמעות:
.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
אנו מודים במעבדה של אולריך שוורץ עבור תוכנת מעקב חישובית המשמש כימות של כוחות המתיחה הסלולר (Sabass et al. 2008). עבודה זו נתמכה על ידי פרס בורוז קריירה Wellcome ופרס פיוניר NIH של מנהל (DP10D00354) כדי ML Gardel רפואי המדען השירות הלאומי לחקר פרס (5 T32 GM07281) חורף SP.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 3-aminopropyltrimethyoxysilane | Aldrich | 28, 177-8 | |
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Fisher Scientific | BP1404 | |
| TEMED | Fisher Scientific | BP 150-20 | |
| Ammonium persulfate | Fisher Scientific | BP179 | |
| מיקרו-ספירות פלואורסצנטיות 40nm | Invitrogen | F8789 | |
| Sulfo-SANPAH | Pierce, Thermo Scientific | 22589 | |
| תא דימות קונפוקלית (RC-30) | Warner Instruments | 64-0320 | |
| ספינר לכיסויי זכוכית | בנייה עצמית | NA | |
| מנורת אולטרה-סגול CL1000 | UVP Inc. | 95-0228-01 | |
| מתקן פלדת אל-חלד | Electron Microscopy Sciences | 72239-04 | |
| acryloyl-X, SE (6-((acryloyl)amino)hexanoic acid) | Invitrogen | A-20770 | |
| הידראזין הידראט | Sigma-Aldrich | 225819 | |
| נתרן מטה-פריודאט | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20504 | |
| איזופרופנול | Fisher Scientific | A416-4 | |
| פיברונקטין | Sigma-Aldrich | F2006 | |
| קולגן | BD Biosciences | 354236 | |
| כיסויי זכוכית (#1.5) | Corning | 2940‐224 | |
| גלוטראלדהיד | Electron Microscopy Sciences | 16120 | |
| Rain-X | SOPUS Products | www.rainx.com | |
| חומצה אצטית | Acros Organics | 64-19-7 |
מקורות
- Damljanovic, V., Lajerholm, B. C., Jacobson, K. Bulk and micropatterned conjugation of extracellular matrix proteins to characterized polyacrylamid substrates for cell mechanotransduction assays. Biotechniques. 39 (6), 847-851 (2005).
- Engler, A., Bacakova, L. N. ewman, Hategan, C., Griffin, A., M, D. D. ischer
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
