Используя спектрально решен двухфотонной микроскопии изображений системы, на уровне пикселей карты Ферстер Резонансная переноса энергии (FRET) эффективности получены для клеток, экспрессирующих рецепторы мембраны гипотеза о форме гомо-олигомерных комплексов. С FRET эффективность карты, мы можем оценить стехиометрических информацию о олигомер комплекс в стадии изучения.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В естественных условиях Количественная оценка G белком рецептор взаимодействий с использованием спектрально Решено Двухфотонное микроскопии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Изучение белковых взаимодействий в живых клетках является важной областью исследований, поскольку информация, накопленная как преимущества, так промышленных приложений, а также увеличивает основные фундаментальные биологические знания. Ферстер (флуоресценция) Резонансное переноса энергии (FRET) между донором молекулы в электронно-возбужденное состояние и близлежащие молекулы акцептора неоднократно использовались для изучения белок-белковых взаимодействий в живых клетках. Белков, представляющих интерес, помеченные двух различных типов флуоресцентных зондов и выразил в биологических клетках. Флуоресцентных зондов возбуждаются, обычно с помощью лазерного излучения, и спектральные свойства флуоресценции выбросов, исходящих из флуоресцентных зондов собираются и анализируются. Информация о степени белковых взаимодействий встроен в спектральных данных о выбросах. Как правило, ячейки должны быть отсканированы количество раз для того, чтобы накопить достаточно спектральной информации точно количественно степень белковых взаимодействий для каждого региона интересов внутри клетки. Тем не менее, молекулярный состав этих регионах может измениться в ходе процесса приобретения, ограничивая пространственного определения количественных значений очевидно FRET эффективность в среднем по всей клетки. С помощью спектрально решен двухфотонного микроскопа, мы имеем возможность получить полный набор спектрально решен изображений после одной полной проверки возбуждения образца интересов. От этого на уровне пикселей спектральные данные, карту FRET эффективность всей клетке рассчитывается. Применяя простой теории FRET в олигомерных комплексов экспериментально полученные распределения FRET эффективности по всей клетке, одну спектрально решен сканирование показывает стехиометрических и структурную информацию о олигомер комплекс в стадии изучения. Здесь мы опишем порядок подготовки биологических клеток (CEREVISIAE дрожжей Saccharomyces), выражающая мембранных рецепторов (стерильные 2 α-фактора рецепторов) с меткой двух различных типов флуоресцентных зондов. Кроме того, мы показываем критические факторы, связанные со сбором данных с помощью флуоресценции спектрально решен двухфотонной микроскопии изображений системы. Использование этого протокола может быть продлен для изучения любого типа белка, который может быть выражен в живой клетке с флуоресцентным маркером прилагается к нему.
Протокол
1. Плазмиды дизайн
Белки интерес слиты в одну из двух различных флуоресцентных меток, как описано далее. Флуоресцентные метки не только предоставлять информацию о месте нахождения белков внутри клетки, но и количественную информацию о гомо-олигомеризации белка 1. Техника флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) 2-4 используется для накопления информации о белковых взаимодействий 5-10. FRET использует принцип, что передача энергии может происходить из оптически возбужденных молекул (как правило, называют донором, D) в невозбужденном молекулы (как правило, называют акцепторными,) через диполь-дипольны....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой презентации мы показали, как определить размер и структурную информацию о белковый комплекс олигомерных в естественных условиях. Хотя данные, представленные была получена из специфическим рецептором мембраны (т.е. Ste2p), выраженные в дрожжевые клетки, этот метод является всеохватывающим, что оно может быть применено к любому типу белок, выраженные в любой тип клеток, единственным условием в том, что белки помечены с соответствующими флуоресцентными маркерами. Будущие модификации данного протокола будет .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была поддержана UW-Милуоки исследований роста инициативы, Висконсин Институт медико-биологических и медицинских технологий, а также Фонда Брэдли.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Пептон | Fisher Scientific | BP1420 | |
| Дрожжевой экстракт | Fisher Scientific | BP1422 | |
| Полиэтиленгликоль 4000 | Hampton Research | HR2-605 | |
| Азотистая основа для дрожжей без (NH4)2SO4 и аминокислотами | Fisher Scientific | DF0335-15-9 | |
| Добавки для синтетической селективной среды для дрожжей | Sigma-Aldrich | Y2001 | |
| D-глюкоза | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Агар | Fisher Scientific | S70210 | |
| Сульфат аммония | Fisher Scientific | A702-500 | |
| Хлорид калия | Acros Organics | 424090010 | |
| Лейцин | Fisher Scientific | BP385 | |
| Гистидин | Fisher Scientific | BP382 | |
| Планарный ахромат, объектив для иммерсии в масле 100x с бесконечной оптической системой, NA=1.43 | Nikon Instruments | ||
| Спектрально-разрешающий двухфотонный микроскоп |
Ссылки
- Raicu, V. Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy. Diaspro, A. , CRC Press. Boca Raton. (2010).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. New York. (2006).
- Raicu, V., Popescu, A.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
