CFSE 可将荧光染料羧基荧光素共价标记到细胞内长寿命的分子上。因此，当 CFSE 标记的细胞发生分裂时，其子代细胞的荧光强度减半，从而可用于评估细胞增殖。本文描述了通常用于 CFSE 标记小鼠淋巴细胞的操作步骤。
本文内容
摘要
摘要
羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）是一种有效且常用的方法，用于监测淋巴细胞分裂1-3。CFSE 可将荧光染料羧基荧光素共价标记到寿命较长的细胞内分子上。因此，当一个被 CFSE 标记的细胞发生分裂时，其子代细胞所含的羧基荧光素标记分子数量减半，从而可通过流式细胞术检测细胞荧光强度的相应下降来评估每一次细胞分裂。CFSE 能够以极高且变异极小的荧光强度标记淋巴细胞群体，加之其细胞毒性低，使其成为测量细胞分裂的理想染料。由于 CFSE 是一种基于荧光素的染料，因此它还可与多种其他荧光染料兼容，适用于多色流式细胞术。本文描述了通常用于标记小鼠淋巴细胞以监测最多 8 次细胞分裂的操作步骤。这些标记后的细胞既可用于体外（in vitro）研究，也可用于体内（in vivo）研究。
方案
1）试剂配制
1.1）CFSE 储存液
CFSE染料以羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFDA, SE）（分子量557.47 g/mol）的形式购得，通常为25 mg的西林瓶装。将25 mg溶于8.96 mL DMSO中，配制成终浓度为5 mM的储存液（分装为50–100 μL，于-20 °C保存数月）。CFDA, SE可与水溶液发生反应，因此在储存过程中必须避免接触水分。
1.2）淋巴细胞
从小鼠的脾脏和/或淋巴结中分离淋巴细胞，并将其重悬于1 mL培养基（例如RPMI）中，培养基中含5%热灭活的胎牛血清（FCS），细胞浓度为0.5 × 106 - 10 × 107/mL。
2) CFSE 标记
2.1）常规方法：
- 将细胞在1 mL培养基中充分重悬，并小心地置于一支新的（未润湿的）10 mL锥形管底部。
- 将管子水平放置（使用未润湿的管子可防止1 mL细胞悬液移动并提前与CFDA, SE溶液混合）。
- 小心地将110 μL PBS加入管顶塑料部分未润湿的区域，确保不与细胞悬液接触。
- 在110 μL PBS中重悬1.1 μL的5 mM CFDA, SE储备液。
- 迅速盖紧管盖，倒置并充分涡旋，以实现溶液快速均匀混合。注意CFSE染料的终浓度为5 μM，但每批配制时可能需要确定最佳浓度，并每6个月检查一次以确保其有效性。
- 室温孵育细胞5分钟。注意CFDA, SE转化为CFSE后（见讨论部分），染料会具有荧光性，因而易因暴露于过强光照而褪色。因此，建议从此步骤开始避光操作，例如用铝箔包裹管子。
- 用10倍体积含5 % HI FCS的20 °C PBS稀释细胞，于20 °C以300 × g离心5分钟，弃去上清液。重复洗涤两次。
2.2）替代方法，同样适用于较高数量的细胞（10 - 30 × 107）：
- 通过将 2 μL 的 5 mM 储备液加入 1 mL PBS 中，配制 2 × (10 μM) CFDA, SE 溶液，并迅速将其加入 1 mL 充分重悬的细胞中，立即盖紧管盖，颠倒混匀并充分涡旋，以实现快速且均匀的混合。
- 室温孵育 5 分钟，然后按照步骤 2.1(f) 和 2.1(g) 进行洗涤。
2.3) 随后可将细胞应用于感兴趣的细胞分裂诱导方案。标记后的细胞可用于以下两种情况 体外 和 体内 检测方法
2.4）增殖实验结束后，收集细胞并进行流式细胞术分析（代表性示例如下所述）。
3) 代表性结果
为了通过CFSE稀释法评估淋巴细胞增殖，有必要了解未分裂细胞（即最大荧光强度）和未标记细胞（即最小荧光强度）的荧光水平。因此，实验设计应包含这些对照。以下是示例 体外 和 体内 使用CFSE通过流式细胞术检测CD8+ T细胞增殖的实验。
3.1) 体外 刺激
图1显示了经CFSE标记的卵清蛋白（OVA）特异性T细胞受体转基因CD8+ OT-I T细胞在与不同浓度OVA致敏的树突状细胞共培养3天后的CFSE谱型。从OT-I小鼠脾脏和淋巴结中纯化的CD8+ T细胞用CFSE标记后，取1 × 105个细胞与3.3 × 104个树突状细胞（DC）共培养。DC在37 °C下用OVA致敏1小时，培养前经两次洗涤。培养3天后，收集细胞并用抗CD8-APC抗体和Hoechst 33258染色，随后进行流式细胞术分析（采集50,000个事件）。图中显示的是活细胞（Hoechst 33258阴性）CD8+细胞。作为对照，单独培养的CD8+ T细胞显示了未分裂细胞的CFSE强度，而未标记细胞则显示了细胞的自发荧光以及可检测细胞分裂次数的下限。请注意，在本示例的每个图中均可观察到4个CFSE峰，表明细胞已发生最多3次分裂。
3.2) 在体 刺激
图2显示了经CFSE标记的OVA特异性T细胞受体转基因CD8+ OT-I T细胞在培养3天后的CFSE谱型 体内 存在情况下 20 μg OVA。从CD45.1同源型OT-I小鼠的脾脏和淋巴结中分离的CD8+ T细胞用CFSE标记，并以5 x 106 通过尾静脉将细胞注射入C56BL/6J（CD45.2+）小鼠体内。2小时后，小鼠经静脉注射 20 μg OVA免疫后3天，收集小鼠脾脏，制备成单细胞悬液，用抗B220-PerCP、抗CD8-APC-Cy7、抗CD45.1-PE-Cy7抗体及Hoechst 33258染色，随后进行流式细胞术分析（采集1,000,000个事件）。活细胞（Hoechst 33258阴性）B220阴性细胞显示于左图，设门分析的CD8+ CD45.1+细胞显示于右图。作为对照，未刺激的CFSE标记CD8+ T细胞显示非分裂细胞的CFSE荧光强度，而未标记细胞显示细胞的自发荧光以及可检测细胞分裂次数的下限。需注意，利用CD45同种异型差异对于区分过继转移的CD8+ T细胞与宿主细胞至关重要，因为前者仅为总CD8+ T细胞中的少数亚群（左图）。本示例中大多数细胞分布在7个CFSE峰内（右图），表明这些细胞最多经历了6次分裂。
图1. CFSE标记的卵清蛋白（OVA）特异性T细胞受体转基因CD8+ OT-I T细胞的应答能力 体外 与不同浓度OVA脉冲处理的DC共培养，数据显示为培养3天后的结果。 注意在无抗原情况下CD8+ T细胞的未分裂群体（浅灰色直方图）以及未标记群体的自发荧光（深灰色直方图）。该图显示基于CFSE稀释峰鉴定的CD8+ T细胞已分裂1-3次，且在较高抗原浓度下分裂的T细胞数量更多。
图2. 将CFSE标记的卵清蛋白（OVA）特异性T细胞受体转基因CD8+ OT-I T细胞过继转移至C57BL/6小鼠后，其对OVA产生应答的能力，数据展示的是过继转移后第3天的结果。 左图：受体小鼠中的CD8+、CD45.1+ OT-I T细胞。右图：CFSE增殖图谱。注意未接受抗原的受体小鼠中未分裂的CD8+ T细胞群（浅灰色直方图）以及未标记淋巴细胞的自发荧光（深灰色直方图）。该图显示了基于CFSE稀释峰所识别的CD8+ T细胞已发生1至6次分裂。
图3. 羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯（CFDA, SE）标记细胞过程中发生的各类分子事件示意图。 有关该过程的详细信息，请参见讨论部分。注意：通常使用通用缩写“CFSE”来描述标记试剂及标记过程，而非“CFDA, SE”。 本图基于Parish4。
讨论
为了理解CFSE的作用原理及其在增殖分析中为何需要快速且均匀的标记，有必要了解CFSE细胞标记的分子基础。该过程可分为两个阶段：1）细胞摄取和2）蛋白质标记（图3）。1）细胞摄取：染料进入细胞依赖于其二乙酸酯形式，即羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFDA, SE）。乙酸基团使该染料具有高度膜通透性，从而能够快速穿过质膜。细胞内的酯酶可裂解CFDA, SE上的乙酸基团，生成CFSE形式的染料，后者膜通透性显著降低，因而使染料在细胞内富集。2）蛋白质标记：尽管CFDA, SE和CFSE均含有氨基反应性的琥珀酰亚胺侧链，但只有CFSE具有荧光性。细胞内高浓度的CFSE可促进细胞内蛋白质迅速且高效地标记。为获得标记均一的细胞群体，CFSE标记细胞的操作必须迅速完成，这对于分辨经历多次分裂的细胞至关重要，如代表性结果所示（图1和图2）。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本文报道的研究工作得到了澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）项目资助（CRP）和NHMRC项目基金（CRP和BJCQ）的支持。此外，BJCQ是NHMRC彼得·多尔蒂博士后研究员。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CFDA,SE | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| DMSO | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| 淋巴细胞 | 例如小鼠或人源 | ||
| RPMI | GIBCO, by Life Technologies | ||
| FCS | SAFC Global | ||
| 10-15 ml 圆锥形离心管 | Falcon BD | ||
| PBS | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 铝箔 | Capral Aluminium | ||
| 涡旋振荡器 | Scientific Industries Inc. | ||
| 离心机 | Eppendorf | ||
| 流式细胞仪 | BD Biosciences |
参考文献
- Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171, 131-137 (1994).
- Parish, C. R., Glidden, M. H., Quah, B. J., Warren, H. S. Use of the intracellular fluorescent dye CFSE to monitor lymphocyte migration and proliferation. Current protocols in immunology. Coligan, J. E. , (2009).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2, 2049-2056 (2007).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77, 499-508 (1999).
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