利用由fosmid携带的基因组DNA为Caenorhabditis elegans构建转基因，具有显著优势，因为可保留全部天然调控元件。本文描述了一种基于galK可筛选标记、通过重组工程构建转基因的简单且稳健的实验流程。
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利用带有galK可筛选标记的重组工程法构建秀丽隐杆线虫（C. elegans）转基因
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
转基因动物的制备在科学研究中被广泛应用 秀丽隐杆线虫 研究包括利用GFP融合蛋白来分析目的基因的调控机制和表达模式，或构建特定基因的串联亲和纯化（TAP）标签版本以促进其纯化。通常通过将启动子置于GFP报告基因或目的cDNA的上游来构建转基因，这种方法往往能够产生具有代表性的表达模式。然而，该方法可能遗漏基因调控中的关键元件，例如3'非翻译区中的调控序列或可变启动子。此外，通常仅能通过此方法研究一种剪接变体。相比之下，使用由fosmid DNA克隆携带的线虫基因组DNA，很可能包含了大部分甚至全部参与基因调控的元件。 体内 从而能够更准确地捕获真实的表达模式和表达时序。为促进利用fosmid DNA构建转基因，我们描述了一种 E. coli 基于重组工程的方法，将GFP、TAP标签或其他目的序列插入基因组任意位置。该方法利用了 galK 基因作为重组工程中正向和负向筛选步骤的筛选标记，从而以高效率获得所需的修饰。此外，含有该基因的质粒 galK 基因两侧带有同源臂，可与常用的GFP和TAP融合基因连接，从而在构建GFP或TAP融合蛋白时使引物成本降低50%。这些质粒采用R6K复制起点，避免了对PCR产物进行繁琐的纯化步骤。最后，我们还展示了一种将目标序列整合到 unc-119 将标记插入到fosmid载体骨架中，使得该fosmid可直接注射或轰击进入线虫，以产生转基因动物。本视频演示了利用重组工程方法构建转基因的详细操作步骤。
方案
概述
用于转基因生物制备的许多转基因 秀丽隐杆线虫 由启动子序列和可能插入实验室构建的载体中的基因cDNA组成，这些载体由Andy Fire博士实验室提供 1尽管这些转基因在产生GFP报告基因或在特定模式下表达cDNA方面通常较为成功，但这些转基因可能缺少在基因表达调控中起重要作用的替代启动子、增强子元件以及3'非翻译区（UTR）元件 体内 2例如，两者均 daf-12 和 fah-1 基因具有位于近端启动子区域之外的重要增强子元件，而仅包含启动子的构建体遗漏了这些元件 3,4,5此外，许多转基因构建体使用 unc-54 3'非翻译区，可防止被相应的微小RNA基因调控 6,7,8因此，利用包含大量线虫基因组DNA片段的转基因将有助于完整捕获所有启动子、剪接变体以及3'非翻译区调控元件。最近一项 秀丽隐杆线虫 已构建包含约40 kb基因组DNA片段且覆盖几乎整个基因组的fosmid文库。利用这些fosmid DNA克隆所携带的线虫基因组DNA，能够更准确地捕获特定基因的真实表达模式和表达时序。 2,8,9,10,11.
然而，操作大片段基因组DNA在实际应用中存在诸多挑战，例如使用标准分子生物学技术时会遇到极大困难12。为克服这些局限，已开发出通过在E. coli中进行同源重组来修饰fosmid或细菌人工染色体的技术，该技术被称为重组工程（recombineering）12,13。重组工程可将绿色荧光蛋白（GFP）、串联亲和纯化（TAP）标签或其他目的序列无缝插入到C. elegans fosmid克隆所携带基因的任意位置2,10,14。同源重组发生在PCR产物与特异性改造的E. coli菌株中的靶DNA之间，其中PCR产物两端含有与靶位点同源的50 bp序列。
我们最近描述了一种用于修饰的两步法程序 秀丽隐杆线虫 fosmid文库通过重组工程进行构建，该过程涉及插入 galK 在目标位置插入基因，然后用目的序列替换该基因 2。 该 galK 该基因可作为此过程两个步骤的有效筛选标记，因其可通过选择性培养基进行正向和负向筛选。 15在fosmid修饰的第一阶段， galK 通过同源重组将基因插入目标位置，并利用能够以半乳糖作为碳源的正向筛选方法鉴定正确修饰的fosmid克隆 2,15在第二阶段， galK 基因被目标序列替换，通过针对未正确修饰的fosmid进行负筛选，从而鉴定出正确修饰的fosmid galK 通过使用毒性半乳糖衍生物脱氧半乳糖（deoxygalactose）杀死细胞来筛选基因 galK+ 细菌 2,15. 该方法的一个优势是 galK 单个基因能够同时用于阳性与阴性筛选步骤，而无需像其他标记那样为每一步使用不同的基因，从而以高效率获得目标修饰 2,15.
为了促进该技术在C. elegans研究中的应用，我们对现有资源进行了多项改进。首先，GFP和TAP标签常用于构建线虫转基因，因此我们在pMOD4 galK-G和pMOD4 galK-GT质粒中引入了分别与这两种标签具有50 bp同源性的区域，这些质粒作为galK基因的来源2。这些同源区域使得在fosmid修饰的两个阶段均可使用同一对寡核苷酸，从而避免了额外订购另一对价格较高的寡核苷酸。其次，这些质粒采用了R6K复制起点，由于该质粒无法在用于重组工程的细菌中复制，只能在EC100等特殊菌株中复制2,16（表1和表2），因此无需对母体质粒进行酶切或对PCR产物进行 extensive 纯化。最后，一种常见的构建转基因C. elegans的方法是通过基因枪轰击（biolistic bombardment），随后利用unc-119突变的表型拯救来筛选转基因线虫17。为了使fosmid适用于轰击转化，我们开发了pLoxP unc-119质粒，可用于将unc-119标记整合到fosmid载体骨架上2。
一、引物设计
通过重组工程，可将目标序列插入基因内的任意位点。常见的插入位点位于5'端或3'端，具体取决于功能结构域、剪接变体或蛋白酶切割等翻译后修饰。本实验室构建的pMOD4 GFP质粒可用于在任意位点插入带FLAG标签的GFP，因为该质粒包含起始密码子且缺少3'端终止密码子（图1）。相比之下，由于纯化过程中需使用TEV蛋白酶进行切割，TAP标签具有专用于5'端融合和3'端融合的特定版本18,19。
- 规划基因内标签插入位点。在选择插入位点时，需考虑替代启动子、功能结构域、选择性剪接以及翻译后修饰等因素。不同的插入位点可用于标记某一特定基因的全部、单一或部分异构体。确定插入位点上下游各50 bp的区域。
- 设计寡核苷酸引物（表1）。可使用IDT公司提供的100 nM规模并经凝胶纯化的寡核苷酸，或Ultramer寡核苷酸进行本实验。
进行galK重组工程时，需设计含有50 bp同源序列的galK引物，该同源序列对应目标修饰位点侧翼区域，引物3'端则与galK盒结合，后者存在于pMOD4 galK-G和pMOD4 galK-GT载体中（图1）。上游引物序列为5'-------50 bp同源序列-------CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA-3'，下游引物序列为5'-------互补链上50 bp同源序列-------TCAGCACTGTCCTGCTCCT-3'。
若使用GFP进行galK重组工程，需设计针对pMOD4 galK-G或pMOD4 galK-GT的引物，其50 bp同源序列对应目标修饰位点的侧翼区域（图1）。务必确保融合蛋白读码框正确。如需要，可省略ATG起始密码子。引物3'端结合于galK盒两侧的GFP同源区域。注：GFP的第一个和最后一个密码子已加下划线以标明读码框。上游引物序列为5'-------50 bp同源序列-------ATGGATTACAAGGACGATGACGATAAGATGAG-3'，下游引物序列为5'-------互补链上50 bp同源序列-------CAAAGCTTGTGGGCTTTTGTATAG-3'。
进行C端TAP标签的galK重组工程时，需设计针对pMOD4 galK-GT的引物，其50 bp同源序列对应目标修饰位点的侧翼区域（图1）。务必确保融合蛋白读码框正确。引物3'端结合于galK盒两侧的TAP同源区域。注：TAP的第一个和最后一个密码子已加下划线以标明读码框。上游引物序列为5'-------50 bp同源序列-------ATGGAAAAGAGAAGATGGAAAAAG-3'，下游引物序列为5'-------互补链上50 bp同源序列-------GGTTGACTTCCCCGC-3'。
进行N端TAP标签的galK重组工程时，需设计针对pMOD4 galK-GT的引物，其50 bp同源序列对应目标修饰位点的侧翼区域（图1）。务必确保融合蛋白读码框正确。引物3'端结合于galK盒两侧的TAP同源区域。注：TAP的第一个和最后一个密码子已加下划线以标明读码框。上游引物序列为5'-------50 bp同源序列-------ATGGCAGGCCTTGCGC-3'，下游引物序列为5'-------互补链上50 bp同源序列-------AAGTGCCCCGGAGGATGAGATTTTCT-3' - 为后续PCR步骤以及fosmid测序，设计一组侧翼引物。这些为标准PCR引物，应结合在插入位点上下游约100 bp的位置。
II. 将Fosmid转移至SW016细菌
来自C. elegans fosmid文库的fosmid由EPI300细菌菌株（F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG trfA tonA）（Epicentre Biotechnologies，Madison，WI）提供，该菌株可将fosmid的拷贝数提升至每细胞一个以上，从而在DNA纯化过程中提高产量（表2）。为了进行重组工程操作，需将fosmid转移至SW106细菌菌株（mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) ΔlacX74 deoR endA1 araD139 Δ(ara, leu) 7697 rpsL recA1 nupG φ80dlacZΔM15 [λc1857 (cro-bioA)<>Tet] (cro-bioA)<>araC-PBAD Cre ΔgalK）（NCI-Frederick），该菌株携带受温度敏感型λ阻遏蛋白调控的λred同源重组基因以及阿拉伯糖诱导型cre重组酶（表2）15。
- 根据 Wormbase 提供的信息，从 GeneService（英国剑桥）订购目的基因（G.O.I.）的fosmid克隆。选择克隆时，应优先选择目的基因位于序列中心的克隆。若能排除邻近基因的克隆更佳，但可能较难获得。
- 在含有12.5 μg/mL 氯霉素的LB培养基中，于37°C培养目的基因的fosmid克隆。
- 培养1.5 mL过夜培养物，使用Epicentre fosmid提取试剂盒（Epicentre Biotechnologies，美国威斯康星州麦迪逊市）进行fosmid DNA的小量提取。我们采用说明书中的替代方案，即在较早步骤中加入Riboshredder混合液。
- 使用分光光度计测定fosmid DNA的浓度。
- 在14 mL带螺帽的试管中，加入5 mL LB液体培养基（含12.5 μg/mL氯霉素），于32°C培养SW106菌株过夜，以制备电转化感受态SW106细胞。
- 将1 mL过夜培养物接种至装有100 mL含氯霉素LB培养基的2 L三角瓶中，将SW106菌液培养至OD600为0.6–0.8。切勿进行热激处理。
- 在5000×g条件下离心5分钟收集菌体，轻轻涡旋重悬沉淀，并加入50 mL预冷的10%甘油溶液。重复此洗涤步骤一次。
- 再次离心收集SW106菌体，并用移液器吸除上清液，每管保留约500 μL上清液。
- 轻轻涡旋重悬菌体沉淀，将100 μL分装至液氮或干冰中速冻，随后于-80°C保存以备后续使用。
- 将fosmid DNA通过电穿孔法转入电转化感受态SW106细胞：使用Eppendorf 2510电穿孔仪，在0.1 cm电击杯中以1350伏电压电击，加入约50 ng的fosmid DNA。
- 将菌液加入1 mL LB培养基中，于32°C恢复培养1小时。
- 取适量菌液涂布于含氯霉素（12.5 μg/mL）的LB平板，于32°C过夜培养。
- 通过菌落PCR验证目的基因的存在。在含12.5 μg/mL氯霉素的LB培养基中，于32°C培养5 mL过夜菌液。取0.5 μL菌液加入标准PCR反应体系，使用侧翼引物进行扩增，并将初始95°C变性步骤延长至5分钟，以在PCR前充分裂解细菌。
- 制备甘油菌保存液，用于长期保存。
III. 通过重组工程插入galK基因
在fosmid修饰的第一阶段，通过同源重组将galK基因插入fosmid中，并通过在仅以半乳糖为唯一碳源的最小培养基上培养来筛选正确修饰的fosmid（图2A）。SW106细菌在最小培养基上生长缓慢，通常需要3至5天才能观察到菌落。
- 制备含有 0.2% 半乳糖的 MOPS 最小培养基平板。MOPS 最小培养基可从 Teknova 公司（加利福尼亚州霍利斯特）购买（目录号 #M2106），但不要使用其中包含的葡萄糖。
含 0.2% 半乳糖的 MOPS 最小培养基（1 L）
将 15 克琼脂在 870 mL 水中高压灭菌
冷却至 55°C 后加入：100 mL 10X MOPS 最小培养基 5 mL 0.2 mg/mL d-生物素（经无菌过滤） 4.5 mL 10 mg/mL L-亮氨酸（1%，加热后冷却并经无菌过滤） 10 mL 20% 半乳糖（高压灭菌） 1 mL 12.5 mg/mL 氯霉素溶于乙醇 2.55 mL 20% NH4Cl 10 mL 0.132 M 磷酸氢二钾 - 使用上述设计的引物，通过 PCR 扩增 pMOD4 galK-G 或 pMOD4 galK-GT 插入片段。我们曾使用 Phusion（New England Biolabs，Ipswich，MA）或 GoTaq（Promega，Madison，WI）。
- 对扩增产物进行凝胶纯化。通过凝胶电泳或 Nanodrop 分光光度计定量回收产量。该 PCR 产物可直接用于步骤 3.14。
- 将含有 fosmid DNA 的 SW106 细胞接种于 5 mL 含氯霉素（12.5 μg/μL）的 LB 培养基中，过夜培养。在 32°C 下生长。
- 将摇动水浴锅预热至 42°C，并在支架中放置一个无菌的 250 mL 锥形瓶。使用摇动水浴锅对于获得高转化效率至关重要。
- 将 1 mL 过夜培养物加入装有 100 mL LB 和氯霉素的 2 L 锥形瓶中。培养至 O.D. 0.6–0.8。通常需要 3–4 小时。
- 将 50 mL SW106 细胞转移至 250 mL 锥形瓶中，在 100 r.p.m. 的摇动水浴中于 42°C 精确热激 20 分钟。将剩余细菌保留在 32°C 作为未诱导对照。
- 将诱导和未诱导的细菌在冰上冷却 10 分钟。
- 将样品转移至两个无菌离心管中，在约 5000×g 条件下离心 5 分钟以收集菌体沉淀。
- 倒去所有上清液，用 1 mL 冰冷的 10% 甘油轻轻涡旋重悬沉淀（即设定为 3–4 档）。
- 重悬后，再加入 49 mL 冰冷的 10% 甘油，然后在约 5000×g 条件下离心 5 分钟收集菌体。
- 重复步骤 3.9、3.10 和 3.11 一次。
- 将离心管倒置以彻底去除上清液，用残留液体（每管约 500 μL）重悬菌体沉淀。分装成 100 μL 每份，干冰上速冻后于 -80°C 保存。可稳定保存数周至数月。（我们通常在此暂停，并于次日进行电转化）。
- 使用 0.1 cm 电转杯，在 Eppendorf 2510 电转化仪上以 1350 伏特对诱导和未诱导的 SW106 细胞进行电转化，每样加入 150 ng PCR 产物。
- 将细菌在 14 mL Falcon 管中的 1 mL LB 培养基中复苏。于 32°C 培养 4.5 小时。
- 在微量离心机中以 13,200 r.p.m. 离心 15 秒收集细菌。将菌体重悬于 M9 培养基中，随后洗涤两次以去除所有富集培养基（配方见下文）。
- M9 培养基（1 L）
- 6 g Na2HPO4
- 3 g KH2PO4
- 1 g NH4Cl
- 0.5 g NaCl
- 高压灭菌
- 第二次洗涤后，弃去上清液，将菌体沉淀重悬于 1 mL M9 培养基中，然后将系列稀释的样品（100 μL 原液、100 μL 1:10 稀释液、100 μL 1:100 稀释液）涂布于 MOPS 最小培养基平板上。
- 在 32°C 培养箱中培养 3–5 天。注意：阳性克隆生长缓慢，请耐心等待。
- 挑取数个单菌落，划线接种至补充有 1% 半乳糖和 12.5 μg/mL 氯霉素的麦康凯琼脂指示平板（BD #281810）。上一步骤中出现的所有菌落应均为 galK+，但为了排除任何 galK- 污染菌，必须在进入第二步前获得单一、亮粉色的单菌落。galK- 菌落为白色或无色，而 galK+ 菌落在 32°C 过夜培养后因发酵半乳糖引起 pH 变化而呈现鲜红/粉红色。
- 挑取单个菌落，接种于 5 mL 含氯霉素的 LB 培养基中，32°C 过夜培养。
- 使用侧翼引物通过 PCR 验证 galK 基因是否正确插入目标位点。取 0.5 μL 培养物加入标准 PCR 反应体系中，并将初始 95°C 孵育时间延长至 5 分钟以裂解细菌。由于 galK 基因的插入，PCR 产物应比原片段更大。
- 制备甘油菌保存液用于长期储存。
IV. 通过重组工程将 galK 替换为标签序列
在此阶段，galK 基因被目标标签序列取代，通过对抗galK基因的毒性半乳糖类似物脱氧半乳糖（DOG）进行筛选，从而选择出正确修饰的fosmid（图2B）。
- 制备含有0.2%脱氧半乳糖（DOG）和0.2%甘油的MOPS最小培养基平板。MOPS最小培养基可从Teknova公司（加利福尼亚州霍利斯特）购买（目录号#M2106），但不要使用其中包含的葡萄糖。
含0.2% DOG和甘油的MOPS最小培养基（1 L）
将15克琼脂加入860 mL水中，高压灭菌
冷却至55°C后加入以下成分：100 mL 10X MOPS最小培养基 5 mL 0.2 mg/ml d-生物素（经无菌过滤） 4.5 mL 10 mg/ml L-亮氨酸（1%，加热后冷却并经无菌过滤） 10 mL 20%脱氧半乳糖（经无菌过滤） 10 mL 20%甘油（经高压灭菌） 1 mL 12.5 mg/ml 氯霉素溶于乙醇 2.55 mL 20% NH4Cl 10 mL 0.132 M 磷酸氢二钾 - 使用第一轮所用的相同引物，或使用较短的GFP或TAP特异性引物（步骤1.2中的内侧序列），从pMOD4 GFP、pBS1761（N端TAP）或pBS1479（C端TAP）中PCR扩增标签片段。若构建多个载体，使用较短引物尤为有利，因为同一PCR产物可用于所有构建。
- 通过凝胶电泳纯化PCR产物，并通过凝胶分析或分光光度法测定其浓度。
- 按照上述步骤3.4–3.13，制备诱导和未诱导的SW106感受态细胞，该细胞携带含有插入galK基因的fosmid。
- 使用Eppendorf 2510电穿孔仪（设定为1350伏特，使用0.1 cm间隙比色杯），将约100 ng PCR产物转入诱导和未诱导的SW106细胞中。
- 在1 ml LB培养基中复苏，置于14 ml带盖试管中，在32°C摇床中孵育4.5小时。
- 按照步骤3.16和3.17洗涤并稀释细菌，将细菌涂布于含0.2% 2-脱氧半乳糖（DOG）和0.2%甘油的MOPS最小培养基平板上。
- 在32°C下孵育三天。
- 挑取四个单菌落，分别在含12.5 μg/mL氯霉素的LB培养基中制备5 mL过夜培养物。用于如上所述的菌落PCR，以确认表达盒已正确插入。我们同时使用较短的GFP/TAP特异性引物和侧翼引物，以验证插入片段的正确性和插入位点的准确性。GFP片段约为800 bp，TAP片段约为550 bp，而galK为1.4 kb。
- 制备甘油菌保存液。
V. 通过 cre-loxP 重组添加 unc-119 基因
利用修饰后的fosmid构建转基因动物的常用方法是基因枪轰击法。该技术使用DNA包被的金颗粒将fosmid DNA导入C. elegans。转基因动物通常通过unc-119转基因对unc-119突变体的表型拯救来鉴定。在此步骤中，通过与pLoxP unc-119质粒进行cre-loxP重组，将unc-119基因以顺式方式插入fosmid骨架中（图2C）。
- 使用步骤2.5-2.9制备携带步骤4.9中修饰型fosmid的SW106感受态细菌。切勿在42°C下诱导。
- 使用Eppendorf 2510电穿孔仪（设定电压为1350伏特）和0.1 cm间隙的比色杯，将50 ng的pLoxP unc-119质粒通过电穿孔转入细菌。
- 在含有0.1%阿拉伯糖的LB培养基中，32°C下恢复培养细菌1小时。
- 取部分菌液涂布于含有50 μg/mL氨苄青霉素和12.5 μg/mL氯霉素的LB平板上，32°C过夜培养。此条件用于筛选pLoxP unc-119质粒整合至fosmid中的克隆。
- 在含有50 μg/mL氨苄青霉素和12.5 μg/mL氯霉素的LB培养基中培养过夜菌液，取0.5 μL用于PCR，以验证unc-119基因的存在，引物为unc-119 F（5'-CAAATCCGTGACCTCGACAC-3'）和unc-119 R（5'-CACAGTTGTTTCTCGAATTTGG-3'）（表1）。
- 制备最终fosmid菌种的甘油保存液。
VI. 大规模Fosmid制备
为了便于获得基因枪轰击所需的较大量fosmid DNA，在此步骤中将fosmid转移至EPI300细菌中。该菌株能够提高fosmid的拷贝数，从而在DNA制备过程中增加产量。
- 在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基中，于32°C培养5.5步骤中的细菌，获得5 mL过夜培养物。取1.5 mL培养液，使用Epicentre fosmid提取试剂盒分离fosmid。
- 将约50 ng的fosmid DNA通过电穿孔转入EPI300细菌中，使用0.1 cm间隙的比色杯，在Eppendorf 2510电穿孔仪上设置1350伏特进行操作。EPI300细菌可从Epicentre Biotechnologies（Madison, WI）购买获得。
- 将细菌在LB培养基中37°C恢复培养1小时，然后将等分试样涂布于含有50 μg/mL氨苄青霉素和12.5 μg/mL氯霉素的LB琼脂平板上。
- 根据试剂盒附带说明，培养并诱导含有修饰后fosmid的EPI300细菌。50 mL诱导培养液可获得>10 μg的纯化fosmid DNA。使用Epicentre fosmid提取试剂盒纯化fosmid DNA。
VII. 轰击
- 使用 10 μg 的 fosmid DNA 对 DP38 蚓株进行轰击，具体方法见文献（D. Hochbaum, A. Ferguson, and A. Fisher, JoVE, in press）。
八、代表性结果
通过重组工程对fosmid进行修饰时，负筛选步骤的稳健性和成功率通常可达到>90%2。本方案完成时间约为2周，使得转基因的制备过程较为快速。其他实验室也已成功应用过该方案20。
| 引物 | 序列 |
| C-term TAP F | ATGGAAAAGAGAAGATGGAAAAAG |
| C-term TAP R | GGTTGACTTCCCCGC |
| FLAG-GFP F | ATGGATTACAAGGACGATGACGATAAGATGAG |
| FLAG-GFP R | CAAAGCTTGTGGGCTTTTGTATAG |
| N-term TAP F | ATGGCAGGCCTTGCGC |
| N-term TAP R | AAGTGCCCCGGAGGATGAGATTTTCT |
| galK F | CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA |
| galK R | TCAGCACTGTCCTGCTCCT |
| unc-119 F | CAAATCCGTGACCTCGACAC |
| unc-119 R | CACAGTTGTTTCTCGAATTTGG |
表1. 用于PCR的寡核苷酸。
| 质粒 | 来源 | 可获取于 |
| Fosmid 克隆 | Geneservice Ltd. | Geneservice |
| pGalK | 15 | NCI-Frederick |
| pMOD4-RT-G | 2 | Addgene |
| pMOD4-galK-G | ||
| pMOD4-galK-GT | ||
| pLoxP- unc-119 | ||
| pMOD4-GFP | ||
| 细菌 | ||
| SW106 | 15 | NCI-Frederick |
| EPI300 | Epicentre Biotechnologies | Epicentre |
| EC100D pir-116 | ||
表2. 菌株与载体的可获得性。
图 1.
pMOD4-galK-G、pMOD4-galK-GT、pMOD4 GFP 和 pLoxP-unc-119 示意图
pMOD4-galK-G 质粒包含位于两侧各 50 个核苷酸同源臂之间的 galK 筛选盒（黑色），这两个同源臂分别与 FLAG（棕色）-GFP（绿色）的 5' 和 3' 末端序列一致；而 pMOD4-galK-GT 质粒的 galK 筛选盒两侧则同时包含 FLAG-GFP 同源区域以及分别与 N 端和 C 端 TAP（分别为蓝色和橙色）的 5' 和 3' 末端一致的 50 个核苷酸同源臂。pMOD4-FLAG-GFP 包含带有 5' 端 FLAG 标签的完整 GFP 筛选盒，pLoxP-unc-119 则包含 unc-119 基因组序列（紫色），并克隆于含有一个 loxP 位点的质粒中。所有质粒均使用基于 R6K 的 pMOD4（红色）骨架，该骨架无法在 SW106 菌株中复制。
图2.
galK 重组工程流程概述
图2A-2C 分别展示了使用galK载体进行重组工程的各个步骤及所需时间。这些图与图2D中合并展示的内容相同，但为便于清晰阅读而单独列出。首先，通过两步法对目标fosmid进行修饰：第一步是在含有与FLAG-GFP或TAP具有50 bp同源序列的区域之间插入galK载体（图2A）；第二步是用FLAG-GFP或TAP替换该载体（图2B）。随后，将用于转基因动物制备的unc-119标记插入fosmid骨架上的LoxP位点（图2C）。
图2D展示了galK重组工程流程的合并示意图。
综合图2A-2C所示内容，概述galK重组工程流程及各步骤所需时间。
图2a. galk 重组工程中 galk 基因的插入。
图2b. 在galk重组工程中插入TAG（GFP/TAP）。
图 2c. 添加 unc-119。
图 2d. galk 重组工程的整合概览。
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讨论
利用fosmid构建转基因可保留所有天然的启动子元件、剪接变体以及3'非翻译区（UTR）调控元件，从而获得更接近天然表达模式的转基因，或在其他方法失败时成功构建功能性转基因5。所获得的转基因可携带多种表位标签，包括GFP或TAP标签。
转基因的构建包含三个步骤，全部在SW106细菌菌株中进行15。第一步，通过重组工程将galK基因整合到待修饰的fosmid中特定目标位点，所用的PCR产物在其两侧带有与目标fosmid互补的同源臂，并在中间携带galK。我们开发的一项改进是，在galK盒中同时整合了用于FLAG-GFP或TAP标签的同源区域，使得同一对寡核苷酸可用于fosmid修饰的第一步和第二步，从而降低了寡核苷酸的合成成本。另一项进一步简化是使用基于R6K的载体，该载体无法在SW106细菌菌株中复制，因此无需对亲本载体进行酶切消化。第二步，用GFP或TAP等标签替换galK盒，从而将标签与fosmid上的目标基因融合。此步骤具有很高的可靠性，通常可获得大量正确修饰...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者感谢Lindsey Nash在技术开发过程中提供的帮助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目AG028977（A.L.F.）、匹兹堡大学老年独立研究中心（OAIC，AG024827）的试点项目资助以及匹兹堡大学的启动资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| FosmidMAX试剂盒 | Epicentre Biotechnologies | FMAX046 | |
| GoTaq | Promega Corp. | M7122 | |
| MOPS培养基 | TEKnova, Inc. | M2120 | |
| 0.132 M 磷酸钾溶液 | TEKnova, Inc. | M2102 | |
| D-半乳糖 | Sigma-Aldrich | G0750 | |
| 2-脱氧半乳糖 | Sigma-Aldrich | D4407 | |
| 生物素 | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| 亮氨酸 | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Phusion DNA聚合酶 | New England Biolabs | F-530S | |
| 麦康凯琼脂基础 | BD Biosciences | 281810 | |
| 阿拉伯糖 | Sigma-Aldrich | A3131 | |
| 氯霉素 | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| 磷酸氢二钠 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| 磷酸二氢钾 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G2025 | |
| Bacto琼脂 | BD Biosciences | 214010 |
参考文献
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