Summary
نحن هنا يبرهن على وجود بروتوكول لتنفيذ يعيش تلطيخ الخلايا التي يمكن استخدامها لاكتشاف مستقبلات الرائحة على سطح الخلايا HEK293T مريح. بالإضافة ، يمكن أيضا استخدامه لفحص للتعبير عن سطح حسي كيميائي أخرى أو مستقبلات GPCRs.
Abstract
ومن المعترف به في العالم حيا على الروائح من شعور الشم. وتوسط في الفئران عن طريق الشم ذخيرة من حوالي 1200 غرام بروتين المستقبلات اقترن (GPCRs) 1 التي افترض لربط جزيئات الرائحة المتطايرة وتحويل الإشارة إلى إشارة خارج الخلية داخل الخلايا بواسطة اقتران مع G Gαolf البروتين. الملزم للodorants إلى المستقبلات ويعتقد اتباع القاعدة اندماجي ، وهذا هو واحد قد ربط مستقبلات الرائحة واحد عدة مستقبلات قد ربط odorants عدة بدرجات متفاوتة 2. وقد الكيمياء الحيوية ، ويشير الى والدراسات ملزم يجند قامت بها مريح بالنسبة لمعظم GPCRs باستخدام الخلايا مغاير. ويمنع استخدام الخلايا لكن غيري لدراسة مستقبلات الرائحة ، لفترة طويلة منذ ذلك الحين على ترنسفكأيشن فشلوا في تصديرها إلى السطح. وقد أثبتت سايتو وآخرون واحد تمرير مستقبلات الغشاء نقل البروتين (RTP) المحرمين الأسرة اظهار التعبير المعززة في الخلايا العصبية الحسية الشمية ويكون بمثابة مرافقين لمستقبلات الرائحة الحركة على السطح في الخلايا مغاير ، عندما شاركت transfected معا 3. لتنفيذ فحوصات البيوكيميائية لمستقبلات باستخدام الخلايا مغاير ، يجب على المرء أولا تحديد إذا كانت قوية التعبير مستقبلات يظهر على سطح الأرض في خط الخلية. يمكن أن يعاير هذا عن طريق المستقبلات مع RTP1S كوصي تليها الخلية الحية تلطيخ لتسمية fluorescently المجال خارج الخلية أو علامة A في المجال حصرا overexpressing خارج الخلية. نحن هنا يبرهن على وجود بروتوكول لتنفيذ يعيش تلطيخ الخلايا التي يمكن استخدامها لاكتشاف مستقبلات الرائحة على سطح الخلايا HEK293T مريح. بالإضافة ، يمكن أيضا استخدامه لفحص للتعبير عن سطح حسي كيميائي أخرى أو مستقبلات GPCRs.
Protocol
1. الإجراء :
الإجراء يتألف من ثلاثة أجزاء على مدى فترة زمنية الانتهاء مجموعه 3 أيام : نقل الخلايا ، وترنسفكأيشن كيمياء سيتولوجية مناعية ، خطوة واحدة نفذت في اليوم الواحد. يجب أن يتم نقل وترنسفكأيشن من الخلايا على مدى اليومين الأولين في ظروف معقمة في غرفة تدفق الصفحي.
اليوم 1 : نقل الخلايا HEK293T للمقايسة التعبير السطح.
- نقل متوسطة (M10) : ميكس المتوسطة الأساسية الدنيا تستكمل مع 10 ٪ (من حيث الحجم) مصل بقري جنيني في حالة عقيمة.
- تنمو الخلايا إلى confluency المطلوب في لوحة الثقافة 100mm ، اعتمادا على عدد من اللوحات المطلوبة لاقامة. من المهم تحديد نسبة الخلايا التي ستنقل إلى تجنب الخلايا متضخمة أو متفرق : على سبيل المثال ، من 100 ٪ متموجة طبق بقطر 100 ملم ، واحدة قد نقل حوالي 3 ٪ إلى 35 مم طبق للحصول على ما يقرب من 30 ٪ في confluency الأخير.
- قبل نقل الخلايا ، في غرفة معقمة التدفق الصفحي ، ومعطف X 22 مم الزجاج ينزلق تغطية 22 العقيمة مع يسين مد بولي (1mg / مل) ، ومكان واحد في كل طبق 35 ملم ثقافة الخلية ، حتى الجانب المغلفة لخلايا الطلاء (الشكل 1 ). يسمح الحل لتجف لمدة 5 -- 10 دقائق. خلال هذا الفاصل الزمني ، قد يتم تشغيل مصدر الأشعة فوق البنفسجية في غرفة الصفحي على زلات لتعقيم الغطاء ، إذا رغبت في ذلك. بولي D يسين يساعد خلايا غيروي التمسك ينزلق الغطاء.
- لنقل الخلايا ، ونضح من وسائل الاعلام الموجودة في الطبق 100mm ، وغسل بعناية بإضافة 8 مل العقيمة برنامج تلفزيوني ، ونضح برنامج تلفزيوني يعرض للتريبسين الخلايا باستخدام 3 مل 0.05 ٪ التربسين - EDTA ، وعندما تنفصل الخلايا من الطبق ، ومنع المزيد من رد الفعل الأنزيمية التي إضافة 5 مل M10. متمزج الخلايا وحجم اللازمة لنقل أنبوب مخروطي العقيمة ؛ الطرد المركزي في 200G لمدة 5 دقائق لخلايا بيليه. نضح من طاف تحتوي التربسين - EDTA ، وترك بيليه خلايا سليمة. لنقل الخلايا إلى أطباق 35 ملم ، إضافة 1 مل M10 لكل طبق ويسحن على فصل الخلايا. إضافة 1 مل من معلق الخلايا إلى كل طبق. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2.
الشكل 1. معطف 22 X 22 مم زجاج coverslips مع مد بولي يسين ومكان واحد حتى في الجانب مغلفة كل طبق 35 مم.
يوم 2 : ترنسفكأيشن HEK293T من الخلايا.
- 18-24 بعد ساعات من نقل ، وخلايا جاهزة للترنسفكأيشن للمستقبلات أن يعاير. استخدام مستقبلات RTP1S والثدييات المستنسخة في التعبير ناقلات PCI ، الذي أعد من الثقافات البكتيرية باستخدام بروتوكول Qiagen كيت Miniprep التالية صفها قبل 4. استخدام المستقبلات التي N عضال الموسومة ب 20 حامض أميني حاتمة رودوبسين طويلة لتسهيل immunostaining.
- استخدام 1000ng من بناء مستقبل ، 250 نانوغرام للبناء و 50 نانوغرام RTP1S من البروتين لكل ترنسفكأيشن مضان أخضر. أداء ترنسفكأيشن باستخدام Lipofectamine 2000 ، وفقا للمصنعين اليدوي.
يوم 3 : كيمياء سيتولوجية مناعية لتصور مستقبلات الخلايا السطحية الملون.
- قبل البدء ، وإعداد وغسيل تلطيخ الحلول وتبريدها إلى درجة مئوية 4 تلطيخ المتوسطة : متوسطة الأساسية الدنيا ، و 45 مل ؛ مصل بقري جنيني ، 5 مل ؛ HEPES (1M) ، 500 ميكرولتر (تركيز النهائي 10MM) ؛ أزيد الصوديوم (1.5M) ، و 500 ميكرولتر (تركيز النهائي 15mM). غسل الحل : HBSS ، 500 مل ؛ HEPES (1M) ، و 5 مل (تركيز النهائي 10MM) ؛ أزيد الصوديوم (1.5M) ، و 5 مل (تركيز النهائي 15mM). قد يتم تخزين كل من الحلول في 4 درجات مئوية لإعادة استخدامها. إعداد الحلول الضد بواسطة تمييع الأضداد المطلوبة في تلطيخ 100 أضعاف المتوسط.
- بدء كيمياء مناعية لتلطيخ السطح لمستقبلات الرائحة حوالي 24 ترنسفكأيشن آخر ساعة. لأداء الخلية الحية تلوين ، مجموعة تجريبية تصل يجب أن يتم تبريده الى 4 درجات مئوية : تعبئة كبيرة الواردة مع الثلج وبات على سطح الجليد لجعله حتى وقت ممكن ، وضع علبة على الجليد ورذاذ مع 70 ٪ الايثانول. قطع قطعة من parafilm (أصغر من طول الدرج) ، ويضعوا على علبة رش الايثانول ، للحصول على سطح أملس. نقل الغطاء الزجاجي قسائم تحتوي على خلايا transfected على parafilm ، واحد في وقت واحد ، حتى الجانب الخلية ، وذلك باستخدام الملقط. طبقة تغطي كل زلة مع 100 ميكرولتر الباردة حل تلطيخ الابتدائي ، البثق بعناية من ركلة ركنية من زلة (الشكل 2). بعد كل طبقات الغلاف مع زلات حل الأضداد ، وغطاء علبة لمنع تجفيف من الحل في الهواء. تنفيذ الحضانة الأولية عن 45-60 دقيقة.
- بعد حضانة الابتدائية ، ونقل بسرعة الى تغطية زلات الأطباق 35mm الثقافة الأصلية ، والتي تحتوي على وسائل الإعلام. نضح في وسائل الإعلام وإضافة 2 مل من محلول الغسيل المبردة برفق من على حافة الطبق لمنع فقدان الخلايا من انزلاق الغطاء. نضح الحل يغسل وكرر مرتين لبإنجاز ثلاث يغسل. في نهاية غسل ثالث ، لا نضح الحل تغسل.
- إعداد الثانوية soluti الأضدادفي وسائل الإعلام ونقل تلطيخ ينزلق الغطاء عن حل لغسل طبقة parafilm اضافته حديثا في علبة واحدة. مرة أخرى برفق قذف 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة لطبقة تغطي كل زلة ، من الزاوية مثل الحضانة الأولية. تنفيذ حضانة الثانوية لمدة 30 -- 45 دقيقة ، ونقل مرة أخرى إلى حل غسل الأطباق الأصلي في 35 ملم. مرة أخرى ، وغسل غطاء ينزلق ثلاث مرات كما هو موضح.
- نضح يغسل من يغسل حل الماضي وإضافة 2 مل بارافورمالدهيد مبردة 1 ٪. إصلاح الخلايا في حل المبردة بارافورمالدهيد 1 ٪ ، على الثلج لمدة 15 دقيقة.
- تحميل زلات تغطية على الزجاج النظيف الشرائح باستخدام المجهر تصاعد Mowiol الكاشف ، مع الجانب الخلية أسفل بحذر واستبعاد جميع فقاعات الهواء (الشكل 3). يجف الهواء Mowiol مرة واحدة ، وغسل غطاء ينزلق بلطف عن طريق إضافة الماء المقطر على السطح والشفط على الفور.
الشكل 2. طبقة ساترة مع 100 لكل ميكرولتر الباردة حل تلطيخ الابتدائي.
الشكل 3. جبل coverslips مع الجانب الخناق على الخلية ميكروسكوب نظيفة الشرائح باستخدام كاشف Mowiol المتزايدة.
2. ممثل النتائج :
يعيش تلوين الخلية تمكن المرء من رؤية البروتينات الموجودة على سطح الخلايا ، على ترنسفكأيشن مع مرافقين من المستقبلات (في هذه الحالة مستقبلات الرائحة Olfr62 ، مع مستقبلات البروتين RTP1S نقل) (الشكل 4). وتتميز الخلايا السطحية للتلوين بواسطة مستقبلات نمط من تلطيخ المنقط (الشكل 4B ، أقحم). نفذت بشكل غير لائق من تلطيخ قد يؤدي إلى ارتفاع الضوضاء ، مما يجعل من الصعب على المراقب أن يميز تلطيخ السطح الحقيقي من الضوضاء. 
الشكل 4. ترنسفكأيشن من المستقبلات مع مرافقين يسمح التصور من البروتينات على سطح الخلايا الحية باستخدام تلوين الخلية. ترنسفكأيشن من مستقبلات الرائحة وحدها Olfr62 (A) وترنسفكأيشن من Olfr62 مع كوصي RTP1S (B). مستويات التعبير GFP بمثابة تحكم ترنسفكأيشن (A 'وباء').
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يجب أن تتم كل خطوة بعناية لضمان بارزة ومميزة تلطيخ السطح. يجب أن تتم العملية بأكملها في تلطيخ الباردة (على الجليد) ، ويجب تبريد الدرج الذي وضعت غطاء ينزلق قبل استخدامها لضمان بقاء الخلايا على قيد الحياة. وعلاوة على ذلك يتم تثبيت في نهاية السطح عملية التلوين. هذا في تناقض حاد مع تلوين الداخلية حيث تسبق التثبيت لتلطيخ permeabilize غشاء الخلية إلى أجسام الابتدائية والثانوية. يجب التقليل من وقت التعرض للزلات لتغطية الجوية لمنع الخلايا من تجفيف ؛ طبقات بالتالي ينزلق الغطاء مع حلول الأضداد ، ونقل زلات غطاء لغسل الحل ، يجب أن يتم تبادل بين حل غسل يغسل بسرعة واحدة في كل مرة عند التعامل مع زلات تغطية متعددة.
اعتمادا على العلامة حاتمة واحد يستخدم الأجسام المضادة ، يمكن للمرء أن ضبط فترة حضانة ، وعدد من يغسل ، وأضعاف التخفيف الأضداد. ويمكن تجنب الضوضاء الخلفية بواسطة تمييع أضداد أكثر أو زيادة عدد يغسل ، أو تقصير فترة حضانة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ونحن نشكر أعضاء المختبر ماتسونامي لقراءة نقدية لهذه المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Minimal essential medium | Sigma-Aldrich | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride |
| HEPES Buffer Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Sodium Azide | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
