メタゲノムライブラリからセルラーゼ活性をBiominingためのハイスループットスクリーニング

Summary

このプロトコルは、大腸菌で発現メタゲノムライブラリーからのセルロース分解活性のためのハイスループットスクリーニングを説明します。画面には、ソリューションベースと高度に自動化され、吸光度測定など最終的な読み出しと384ウェルマイクロプレートでのワンポット化学を使用しています。

Abstract

セルロース、地球上の有機炭素の最も豊富な源は、バイオ燃料生産の¹の増加を重視した幅広い産業用途を持っています。セルロースを変更したり、劣化させる化学的方法は、通常、強酸と高温を必要とする。このように、酵素法は、生物変換プロセスで顕著になっている。細菌および真菌分離株からのアクティブなセルラーゼの識別がやや効果があった一方で、自然界における微生物の大半は、実験室培養をレジスト。また、メタゲノム、スクリーニングの手法として知られている環境のゲノムは、新たな生物変換酵素の検索で栽培ギャップを埋めることに大きな期待を持っている。土壌^2、水牛ルーメン³とコンゴレッド色素（Teatherとウッド⁵の方法に基づいて）で染色されたカルボキシメチルセルロース（CMC）寒天プレートを使用してシロアリ後肢腸⁴など様々なメタゲノムスクリーニングのアプローチが成功した環境からの新規セルラーゼを回復した。しかし、CMCメソッドは、スループットに制限され、定量的ではなく、ノイズ比⁶に低信号が現れます。他の方法は^、7,8の報告が、それぞれが大規模な挿入のゲノムライブラリーのハイスループットスクリーニングのための望ましくない寒天プレートベースのアッセイを、使用されています。ここでは、ソリューションベースの発色ジニトロフェノール（DNP）- cellobioside基板^9を使用^して、セルラーゼ活性のための画面を提示する。私たちの図書館は、コピー数の誘導¹⁰を介して分析感度を向上させるフォスミドPCC1コピー制御にクローニングした。方法は、吸光度測定として提供される最終的な読み出しと384ウェルマイクロプレートでのワンポット化学を使用しています。この読み出しは、付属のスタッキングシステムを持つ液体ハンドラとプレートリーダーを使用して一日あたりの100倍、384ウェルプレートまでのスループットと、定量的な敏感と自動化です。

Protocol

このプロトコルを開始する前に、384ウェルプレートフォーマットで保存されているメタゲノムライブラリーが必要になります。私たちの研究では、ファージT1 -耐性TransforMax EPI300 - T1 ^R E.との組み合わせでPCC1コピー制御フォスミドベクターを使用ライブラリのホストおよび-80 ° C ^11時に私たちのプレート格納されているとして大腸菌細胞。

1。メタゲノムライブラリーのプレートの複製

1. 37あなたのライブラリが含まれている霜取りプレート℃で約20分、またはまで、全てのウェルが解凍されています。
2. 15分間ロボットを殺菌するqPix2にUV光殺菌機能を使用してください。
3. 500mLに試薬瓶に100ug/mLで12.5ug/mLとアラビノースの最終濃度でクロラムフェニコールを含むLB培養液を準備します。各プレートは、約20mlの使用に加え、デッドボリュームを可能にするために追加の50mLのを行います。
4. 滅菌チューブを介してマニホールドに接続されたメディアのボトルを持つあたりは、メーカーの指示としてqFill3を設定します。メディアの適切な量のためにそれをプログラムし、各ウェルに45uLボリュームを埋めるように設定します。
5. メディアが多様体の各端子からの表示されるまで、ロボットのパージ機....

Discussion

E.で表される大規模な挿入のゲノムDNAのメタゲノムライブラリーからのセルロース分解活性の迅速な検出のためのハイスループットスクリーニング大腸菌は、このプロトコルで説明されています。このメソッドは、一般的に文献で使用されるCMC /コンゴーレッドアッセイよりも優れています。それは解決策に基づいており、定量分析を可能にするプレートリーダーからの吸光度として最終的な出力で、384ウェルプレートでのワンポット化学のスクリーニングが可能になります。このプロセスの各ステップの自動化は、時間あたり25以上の384ウェルプレートの教師なしスクリーニングすることができます。データは、簡単にサードパーティ製のソフトウェアによって分析や処理を可能にする、Microsoft Excelのスプレッドシートにソフトウェアからエクスポートすることができます。

このアッセイの一つの制限は、E.における外来タンパク質の発現の可能性に存在大腸菌宿主。メタゲノムライブラリーは多くの異なる生物からのDNAが含まれている、のサブセットのみが.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
qPix2	Genetix		384ピングリッディングヘッド付き
qFill3	Genetix		384ウェルマニホールド付き
Varioskan	Thermo Fisher Scientific, Inc.
RapidStak	サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社		Varioskan
Micro90 Detergent	Cole-Parmer	18100-00	希釈 水で 2% に希釈
エタノール	メジャー ラボ サプライヤー		で 80% に希釈
クロラムフェニコール	Sigma-Aldrich	C0378	12.5mg/mL エタノール
LB ブロス、Miller	Fisher Scientific	BP1426-2	25g/L、オートクレーブ
384ウェル平底板	Corning	3680
L-(+)-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256	100mg/mL 水
溶液 酢酸カリウム	Fisher Scientific	P171	50mM 水中、オートクレーブ滅菌、pH 5.5 に調整、HCl
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Trizma hydrochloride	Sigma-Aldrich	T3253	TE緩衝液中、100mM
EDTA二ナトリウム塩	Sigma-Aldrich	E5134	TE緩衝液中、10mM
2,4-ジニトロフェニルセロビオシド			Steve Withers博士提供、UBC
ジメチルスルホキシ	Sigma-Aldrich	D8418