تنقية الأسلاف من الهيكل العظمي والعضلات

Summary

طريقة لتفارق الأنزيمية ، ووضع العلامات السطحية وتنقية بواسطة الخلوي تدفق الليفي / مكون الشحم والأسلاف عضلي من الهيكل العظمي والعضلات الفئران.

Abstract

يحتوي على العضلات والهيكل العظمي من السكان من أصول متعددة السلف جنينية متميزة وإمكانات النمو. الأسلاف عضلي ، ويقيم عادة في "خلية موقف فضائية" بين غشاء البلازما myofiber والغشاء القاعدي laminin الغنية التي ensheaths عليه ، وتجديد الخلايا الذاتية التي تلتزم فقط إلى ^1،2 النسب عضلي. وقد وصفت لنا في الآونة الأخيرة من الدرجة الثانية من أسلاف السفينة المرتبطة بها والتي يمكن أن تولد خلايا شحمية بيضاء وmyofibroblasts ، الذي يستجيب للضرر عن طريق إدخال بكفاءة الانتشار وتقدم الدعم الغذائي للخلايا المنشأ العضلي أثناء تجديد الأنسجة ^3،4. واحدة من المقايسات الأكثر ثقة لتحديد إمكانات نمو والتجدد من السكان تعتمد على خلية معينة من عزلتهم وزرع ^5-7. تحقيقا لهذه الغاية ونحن الأمثل لتنقية البروتوكولات من خلال التدفق الخلوي من العضلات نأت إنزيمي ، وهو ما سيوضح في هذه المقالة. سوف السكان الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة تحتوي على أي خلايا مولدة للعضل أو مستعمرة الليفي / تشكيل مكون الشحم : لا يوجد أنواع الخلايا الأخرى قادرة على التوسع في المختبر أو على قيد الحياة في الجسم الحي التسليم. ومع ذلك ، عندما يتم استخدام هؤلاء السكان على الفور بعد فرز للتحليل الجزيئي (مثلا qRT - PCR) واحد يجب أن نضع في اعتبارنا أن مجموعات فرعية فرزها حديثا قد تحتوي على خلايا الملوثات الأخرى التي تفتقر إلى القدرة على تكوين مستعمرات أو engrafting المتلقين.

Protocol

1. الانسجة المجموعة :

1. استخدام الفئران في الفترة بين 7 و 12 أسابيع من العمر. عادة ، يتم استخدام اثنين على الاقل من الحيوانات : واحد هو اقامة نظام مراقبة الأصول الميدانية أحادية اللون الضوابط المطلوبة للحصول على تعويض عن ومضان ناقص واحد ومراقبة العينات isotype. والآخر هو عينة الفعلي للفرز.
2. الموت ببطء في الفئران عن طريق الاستنشاق أو ₂ أكسيد الكربون وفقا لبروتوكول أخلاقيات الاختيار. الفئران مكان على منشفة ورقية ، ومواجهة ، ورذاذ مع الايثانول 70 ٪ جيدا لمنع التلوث مع الفراء الماوس.
3. رفع الجلد في منطقة البطن بالملقط ، ثم إجراء قطع صغيرة طولية مع مقص حاد.
4. قشر الجلد اثنين من اللوحات في اتجاهين متعاكسين (صعودا وهبوطا) للكشف عن كامل عضلات الأطراف الخلفية تحت.
5. استئصال الأنسجة العضلية عن طريق إدراج وتوسيع المقص على طول جانبي الساق.
6. كرر نفس العملية لعظمة الفخذ لاستخراج الأنسجة العضلية.
7. إخضاع جميع الأنسجة العضلية رفعه في أطباق بتري - 60mm ، باستخدام طبق واحد عن كل من الأنسجة الماوس.
8. كرر ما سبق لجميع الفئران.

2. فصل في خلايا الأنسجة واحدة بواسطة الهضم الأنزيمية :

طوال هذا الجزء من البروتوكول ، واستخدام أدوات معقمة والكواشف والعمل تحت ظروف معقمة.

9. إضافة 2 مل من الثانية كولاجيناز (سيغما ، القط # 6885 ، 500u / مل) و 20 ميكرولتر من الأسهم 250mM ₂ CaCl إلى كل صحن بتري.
10. تمزق النسيج العضلي الى قطع صغيرة (حوالي 1 ملم ³⁾ مع اثنين من ملقط (واحدة مسننة ، واحدة مع 2 الأسنان ، والعلوم من أدوات الجميلة ، القط # 11051-10 ، 11154-10) ، مع إيلاء اهتمام لإزالة والتخلص من أكبر قدر الملوثة غير ممكن الأنسجة العضلية.
11. تغطية بيتري ، أطباق واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
12. استرداد أطباق بتري ، واستخدام حقنة 3 مل المكبس لالهريس جيدا قطعة النسيج. استخدم أحد الغواص عن كل عينة لتجنب التلوث.
13. إضافة بعض (~ 5 مل) العقيمة الباردة PBS إلى كل طبق بيتري ، ونقل الحمأة الأنسجة في أنبوب فالكون 50mL (شطف طبق بيتري إذا لزم الأمر لاسترداد كافة الأنسجة)
14. هزة بقوة فالكون الأنبوب ، وملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني ، الطرد المركزي @ 800rpm × 5 دقائق (إيبندورف النموذجي مقعد العلوي : 5810R) ، ونضح وطاف (اكرر 3 مرات)
15. إضافة خليط من 1mL D كولاجيناز (روش ، القط # 11088882001 ، 1.5u / مل) / Dispase الثاني (روش ، القط # : 04942078001 ، 2.4u / مل) و10μL من CaCl ₂ (250mM) لكل أنبوب ، في احتضان 37 درجة مئوية مع دوران لمدة ساعة.
16. إضافة مل 5-10 ، معقمة دوامة الباردة ، في برنامج تلفزيوني وماصة جيدا لتجانس الأنسجة.
17. ملء أنابيب مع برنامج تلفزيوني وتخلط جيدا.
18. تحويل السائل الى مصفاة 40μm الخلية وضعت على رأس أنبوب 50 مل فالكون لتصفية القطع المتبقية كبيرة من الأنسجة. تقسيم كل عينة بالتساوي في أنابيب فالكون three 50mL. تملأ كل من أنابيب الطرد المركزي ثم مع PBS @ 1600rpm لمدة 5 دقائق في 8 درجات مئوية.
19. تجاهل طاف وجمع الخلايا للتلوين.

3. يلطخ الأضداد والفرز :

طوال هذا الجزء من البروتوكول ، واستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية معقمة ومخازن لجمع والعمل تحت ظروف معقمة. تعتبر عموما الأضداد تجارية عقيمة إذا ما تم تناوله بشكل صحيح.

20. للون واحد ومراقبة العينات isotype ، resuspend العينة في المخزن FACS 1mL وتقسيم الخلايا علقت في تسع 1.5mL أنابيب إيبندورف قبل المسمى (100 ميكرولتر كل أنبوب).
    1. إعداد واحد لون يمزج تلطيخ وفقا للجدول التالي :
       تنبيه : إن تركيز الأجسام المضادة السيطرة النهائية isotype صمة عار في المباراة التي ينبغي للجسم الابتدائية هم مراقبة. على سبيل المثال ، إذا تم استخدام المضادة للهيئة السلع التموينية - 1 : 1 ⁶ خلايا μg/10 ، يجب استخدام isotype المناظر له في نفس التركيز.
       

       أنبوب #	اسم أنبوب	شركة	القط #	استنساخ	isotype	تخفيف
       1	غير ملون
       2	Hoechst33342	سيغما	B2261			2-5ug/ml
       3	PI	سيغما	P4864			1ug/ml
       4	CD31 - FITC CD45 - FITC	ebioscience	11-0311-85	390	الفئران IgG2a	500
       		قدم البيت		I3 / 2	الفئران IgG2b	500
       5	Sca1 - PECY7	ebioscience	25-5981-82	D7	الفئران IgG2a	5000
       6	α APC - 7	قدم البيت		R2F2	الفئران IgG2b	1000

    2. إعداد isotype تلطيخ السيطرة يمزج باستخدام الجدول التالي :
       

       أنبوب #	اسم من أنبوب	هويشت	PI	CD31 - FITC	CD45 - FITC	Scal - PE - CY7	A - 7 - APC	الجرذان IgG2b - APC	الجرذان IgG2a - pecy7	الجرذان IgG2a - FITC	الجرذان IgG2b - FITC
       7	ISO - CD31 / CD45	+	+	--	--	+	+	--	--	+	+
       8	ISO - Scal - pecy7	+	+	+	+	--	+	--	+	--	--
       9	ISO - α - 7 - APC	+	+	+	+	+	--	+	--	--	--

    3. الماصة لسيطرة اللون والنظائر يمزج تلطيخ واحد (عادة ما نقوم بتعديل تركيز الأجسام المضادة بحيث يتم إضافة ما بين 5 و 10 ميكرولتر من مزيج لتلطيخ كل عينة) في أنبوب إيبندورف المناسبة من الخطوة 20. مزيج جيد واحتضان على الجليد لمدة 1 ساعة.
21. وصمة عار من خلايا الفأر مع عينة من 800μL كوكتيل الأضداد (أدناه) لفرز الخلايا FACS. مزيج جيد واحتضان على الجليد لمدة 1 ساعة.
    كوكتيل الأضداد : هويشت ، PI ، CD31 - FITC ، CD45 - FITC ، Sca1 - PECY7 ، α - 7 APC
    تنبيه : يجب تحديد النسبة المثلى من الأجسام المضادة لخلايا فردية عن طريق المعايرة كل الأضداد ، حيث أن هناك خلافات كبيرة قد تكون موجودة بين دفعات. وينبغي التعبير عن كمية الأمثل لأجسام مضادة لاستخدامها في μgs من الأجسام المضادة بنسبة 10 الخلايا المستهدفة ⁽⁶⁾ وبقائه ثابتا عند استخدام نفس دفعة من الأجسام المضادة. بوضوح ، وإذا كان عدد الخلايا المستهدفة لا يتغير بشكل ملحوظ بين التجارب ، أو إذا تم تحجيم حجم تلطيخ مع عدد من الخلايا ، يمكن أن تستخدم أيضا التخفيف من الثابت أن كل الأجسام المضادة.
22. غسل : إضافة 1mL تقريبا العازلة FACS إلى كل من أنابيب السيطرة 9 ؛ إضافة 20mL تقريبا العازلة FACS إلى أنبوب العينة.
23. أنابيب الطرد المركزي إيبندورف @ 3000rpm لمدة 5 دقائق (إيبندورف المقعد العلوي للطرد المركزي ، الموديل : 5417C). الطرد المركزي أنبوب عينة @ 1600rpm لمدة 5 دقائق (إيبندورف الطرد المركزي أعلى مقاعد البدلاء ، والموديل : 5810R).
24. نضح وتجاهل طاف من أنابيب للجميع.
25. Resuspend الخلايا في المنطقة العازلة FACS (1mL لكل من الضوابط ، 4mL للعينة الفرز) ، والخلايا الماصة في "أنابيب FACS" من خلال مصفاة غطاء الخلية (فالكون القط # 352235 دينار بحريني ، 40μm حجم المسام) لإزالة كتل المتبقية التي قد تؤثر في عداد الكريات.
26. تأسيس فارز FACS مع الضوابط لون واحد والضوابط isotype.
27. جمع الخلايا مصنفة وفقا للجدول التالي في جمع 3.5 مل العازلة (95 ٪ DMEM ، 5 ٪ FBS) بشكل منفصل. عادة ، عندما حصد كل من أطرافه الخلفية ، يمكن لاحد الماوس نوع المحصول البرية حوالي 150،000 الخلايا الاصلية عضلي أو 100،000 الخلايا الاصلية مكون الشحم ، مع بقاء تزيد عن 95 ٪ ، كما تقرره reanalyzing الخلايا التي تم فرزها حسب نظام مراقبة الأصول الميدانية في نهاية الإجراء (الشكل 1 )
    تعريف الأسلاف عضلي مكون الشحم واستنادا إلى تلطيخ السطح
    --

    الأضداد / وصمة عار	عضلي السلف (MP)	مكون الشحم السلف (ا ف ب)
    هويشت	+	+
    PI	--	--
    CD31 - FITC	--	--
    CD45 - FITC	--
    Sca1 - PECY7	--	+
    α APC - 7	+	--

4. زرع :

28. الطرد المركزي الخلايا فرز @ 1500rpm لمدة 5 دقائق ، وإزالة الخلايا طاف ونقل إلى تعقيمها إيبندورف أنابيب (1.5 مل) ، وشطف الخلايا مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة (المصل مجانا!) ، ثم الطرد المركزي @ 3000rpm لمدة 5 دقائق. صيانة جميع الكواشف في ظروف معقمة والعمل في نسيج الثقافة هود ، resuspend الأسلاف عضلي في برنامج تلفزيوني ، أو السلف مكون الشحم في Matrigel دينار بحريني (القط # 354234) في حوالي 10 ⁶ خلية / مل.
29. زرع الأسلاف عضلي أو السلف مكون الشحم على الفئران المتلقية.
    1. تخدير والفأر مع isoflouran وفقا لسياسة المؤسسة الخاصة بك.
    2. حلق الشعر في جميع أنحاء المنطقة الحقن ، ثم تعقيم الجلد عن طريق فرك مع الايثانول 70 ٪
    3. حقن عضلي 20μL من الأسلاف أو الأسلاف مكون الشحم (= 20K الخلايا) باستخدام الانسولين CC 10/03 حقنة دينار بحريني (القط # 309300).
30. بعد وقت مناسب (ثلاثة أسابيع يعمل بشكل جيد ، ولكن التعبير عن myofibers المانحة المستمدة من علامات المعدلة وراثيا وعادة ما تكون وضوحا في غضون أسبوع واحد بعد زرع) ، تخدير الفئران المستفيدة من الخطوة 29 عن طريق الحقن داخل الصفاق من 400 آفيرتين ميكرولتر (سيغما القط # T04840 - 2 ، 25 ملغ / مل) ، ثم يروي transcardially مع 50mL PBS (يحتوي على 10 ميكرومتر من EDTA) أولا ، تليها 15mL PFA من 4 ٪. الهدف جمع الأنسجة ، وبعد إصلاح PFA مع 4 ٪ بين عشية وضحاها إذا لزم الأمر ، ثم نقل إلى السكروز 20 ٪ بين عشية وضحاها. تضمين في التجميد ، وcryosection أكتوبر.

5. ممثل النتائج :

عندما يتم زرعها في عضلات الفأر النائب الهيكل العظمي ، فإنها بسهولة مع الصمامات الموجودة من قبل myofibers. ولذلك فإن أي تسمية الوراثية الموجودة في خلايا يمكن كشفها بسهولة المانحة في الألياف التي حصلت عليها. ويبين الشكل 2 مثالا حيث الخلايا التي تم زرعها وأعرب phostphatase القلوية الإنسان ، كشفت histochemically.

عندما يتم زرعها AP النتيجة هي تعتمد اعتمادا كبيرا على البيئة في موقع الزرع : عندما زرع هذه الخلايا تحت الجلد يعطي لأصول الخلايا الشحمية وmyofibroblasts (انظر الشكل 2). في العديد من المواقع الأخرى ، بما في ذلك العضلات ، وأنها لا البقاء على قيد الحياة ما لم يكن قد تم بفعل انحطاط الدهنية ^3.

الشكل 1. فرز استراتيجية لعزل السكان السلف من الهيكل العظمي والعضلات (أ) استراتيجية الفرز : تم تحديد خلايا قابلة للحياة تستند إلى الأمام ومبعثر مبعثر الجانب. وقد استخدم هويشت تلطيخ لاستبعاد الحطام عديم النواة وpropidium يوديد تلطيخ (PI) لاستبعاد الخلايا الميتة. استبعدت للدم (CD45) والبطانية (CD31) الخلايا من البوابات الفرز. وα7 ^{+ +} PI هويشت ^-- CD45 ^-- CD31 ^-- Scal ^-- فرعية تحتوي على كافة الأسلاف عضلي (MP). ^{و+ +} PI Scal هويشت ^-- CD45 ^-- CD31 ^-- α7 ^-- يحتوي على السكان الأسلاف مكون الشحم (CNN). (ب) الإسفار ناقص واحد والضوابط isotype (FMO) ، أن تؤكد على خصوصية وصمة عار. (C) الطهارة الشيكات فرعية النائب وAP بعد الفرز.

الشكل 2. وقد تم زرع النتائج التالية ممثل النائب وزرع AP AP. تحت الجلد (اللوحة العلوية) والنائب عضليا (اللوحة السفلية). في كلتا الحالتين ، والخلايا المانحة نشأت من التعبير عن ماوس وراثيا الفوسفاتيز القلوية الإنسان ، والتي حددها تلوين البني.

Discussion

الهدف من هذا البروتوكول هو تحقيق توازن معقول بين عوائد عالية وقابلية عالية للخلايا النقية. الخطوة الأكثر أهمية في ضمان أن يتم استرداد الخلايا السليمة وكما كان متوقعا ، وتفكك النسيج الأنزيمية للانطلاق. وينبغي التعامل مع الأنسجة بشكل خاص أن يكون لطيف ، والتي من الصعب إثبات أو حتى نقدر في شكل السمعي البصري. عاملا رئيسيا آخر هو طول الداخلي. أطول يستغرقه الانتقال من الجهة المانحة إلى الحيوان المتلقي ، وأقل جدوى ، وبالتالي كفاءة engraftment. يجب أن يكون هناك أي سؤال حول الجدوى التي لم يتم الإجابة على الفور من خلال النظر في وتيرة الحدث PI إيجابية في عينات خلايا النقي بعد الفرز ، ونقترح أن يتم إجراء فحص لقياس الحد من تخفيف clonogenicity ^3. أنواع نموذجية من العضلات غير التالفة العائد بشكل روتيني حوالي 1 في 15-20 خلايا قادرة على الشروع في المنشأ العضلي الليفي أو / مكون الشحم المستعمرات في المختبر. بينما اساسا 100 ٪ من المستعمرات التي انطلقت من النواب تتضمن myotubes متباينة ، إلا حوالي ثلث عدد المستعمرات التي تم الحصول عليها من FAPs تحتوي على الخلايا الشحمية ، بالإضافة إلى سلسة myofibroblasts أكتين العضلات إيجابية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C-6885,	500 u/ml
Collagenase D	Roche Group	11088882001	1.5 u/ml
Displace II	Roche Group	04942078001	2.4 u/ml
cell strainer	BD Biosciences	352340	40 μm
Tube with cell strainer	BD Biosciences	352235	40 μm
H–chst33342	Sigma-Aldrich	B2261	2-5 ug/ml
CD31-FITC	eBioscience	11-0311-85	Clone 390
CD45-FITC	Home made		Clone I3/2
Sca1-PECY7	eBioscience	25-5981-82	Clone D7
α-7 integrin APC	Home made	Inquire with Rossi lab	R2F2