هذا الفيديو يوضح الإجراء لعزل العقول كلها من ذبابة الفاكهة الكبار في التحضير لتسجيل واحدة من الخلايا العصبية باستخدام معيار تكنولوجيا الخلية بأكملها. وهو يتضمن صورا للخلايا العصبية وصفت GFP شوهدت أثناء التسجيل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تسجيلات كاملة من خلية دماغ ذبابة الفاكهة الكبار
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في هذا الفيديو ، ونحن لشرح إجراءات عزل العقول كلها من ذبابة الفاكهة الكبار في التحضير لتسجيل من الخلايا العصبية واحدة. نبدأ بوصف حل تشريح والاستيلاء على الإناث البالغات المستخدمة في دراستنا. ويتضح هذا الإجراء لإزالة الدماغ كله سليمة ، بما في ذلك كل من الفصوص البصرية. ويرد أيضا تشريح القصبة الهوائية الفوقية. الدماغ معزولة ليس فقط صغير ولكن يحتاج إلى عناية خاصة في التعامل في هذه المرحلة لمنع تلف الخلايا العصبية ، وكثير منها بالقرب من السطح الخارجي للنسيج. نظهر كيف يتم استخدام حامل الخاصة التي قمنا بتطويرها لتحقيق الاستقرار في الدماغ في غرفة تسجيل. تشكيل لالكهربية هو معيار يستخدم للحصول على تسجيل واحد من الخلايا العصبية أو أزواج من الخلايا العصبية. صورة الفلورسنت ، وينظر من خلال المجهر التسجيل ، من خط القيادة GAL4 GFP التعبير (GH146) يوضح كيف يتم تحديد الخلايا العصبية الإسقاط (PNS) في الدماغ حية. صورة رفيع Nomarski الطاقة يظهر عرض للعصبون واحد هو استهداف لتسجيل الخلية بأكملها. عندما تتم إزالة بنجاح دون ضرر في الدماغ ، والغالبية العظمى من الخلايا العصبية نشطة بشكل عفوي ، إطلاق إمكانات العمل و / أو العارضة مدخلات متشابك عفوية. هذا في إعداد الموقع ، والتي يمكن الجمع بين كل خلية من الخلايا العصبية تسجيل المحددة في الدماغ كله مع التلاعب الجيني والدوائي ، هو نموذج مفيدة لاستكشاف الفيزيولوجيا الخلوية واللدونة في الجهاز العصبي المركزي للبالغين.
البروتوكول
أولا تشريح أدمغة البالغين من الطيران
- وضع قطرة صغيرة (~ 100 ميكرولتر) للتشريح في حل وسط طبق بيتري 35 مم.
- الصيد البالغات باستخدام الشافطة. تحت المجهر تشريح ، واستخدام إبر المحاقن اثنين إلى قطع رأس ذبابة.
- رئيس المركز في قطرة صغيرة من المياه المالحة تشريح (مع غراء المضافة) في طبق بتري.
- رئيس المركز مع مع خرطوم التي تواجه قاع الطبق.
- عقد إهاب المركب الذي يغطي العين اليسرى مع إبرة 1. اجراء خفض قطري التي تمتد من الظهرية الى السطح البطني مع إبرة 2 ، الإنسية لمجرد إبرة 1.
- مع الاستمرار على فمها واستخدام إبرة 1 إبرة 2 الى اجراء خفض الأفقي الذي يمتد من السطح البطني من العين اليسرى إلى العين اليمنى ، على مستوى القاعدة من خرطوم.
- عقد إهاب المركب الذي يغطي العين اليمنى مع إبرة 1. اجراء خفض قطري التي تمتد من الظهرية الى السطح البطني مع إبرة 2 ، الإنسي فقط من إبرة 1.
- استدارة الرأس بحيث الجانب منقاري على سطح طبق بتري. ادخال ابرة 1 بين جليدة منقاري والدماغ ، واستخدام إبر 2 لمتابعة مسار نفس الإبرة الأولى. من الناحية المثالية ، سوف تكون الكبسولة قشر بعيدا عن الدماغ مع كل من الفصوص البصرية منذ تولي هذه المهمة في تحقيق الاستقرار في الدماغ للتسجيل.
- تتم إزالة بعناية القصبة الهوائية والحويصلات الهوائية ، وغيرها من الأنسجة الضامة باستخدام اثنين ملقط غيض الغرامة.
- يجب تشريح كامل يستغرق 3-10 دقائق
II. تركيب الجهاز العصبي المركزي
- يتم نقل الدماغ إلى غرفة تسجيل باستخدام الماصة غيض الصفراء.
- في غرفة التسجيل ، واستقرت في الدماغ عن طريق وضع مثل هذا الإطار أن اثنين من البلاتين عبر الشعر الجميلة التي تجعل الاتصال مع الأنسجة عند تقاطع بين الفصوص البصرية والمنطقة المركزية في المخ.
- يسمح لكل الدماغ الى الراحة في غرفة مع تسجيل مستمر مع نضح المياه المالحة الاوكسيجين (95 ٪ أكسجين و 5 ٪ ثاني أكسيد الكربون) ما لا يقل عن 10 دقائق. هو استمرار التروية للغرفة مع الاوكسيجين المالحة طوال فترة التسجيل. هو إعداد تصور باستخدام المجهر تستقيم (Axioskop 2FS ؛ زايس ، Oberkochen ، ألمانيا) مع مرحلة ثابتة وغمر المياه 40X الهدف (Achroplan ؛ الفتحة العددية ، 0.8 ؛ زايس) والبصريات Nomarski. واعتبر GFP مع فلتر BP مضان 505-530.
III. الكهربية
- وتستخدم Pipets من 8-14 Mohms للتسجيلات خلية كاملة
- تجرى التسجيلات الجاري المشبك المشبك والجهد التي تستخدم قائمة EPC7 أو مضخم Axopatch 200B ، وهو 1322A Digidata DA المحول (الأجهزة الجزيئية ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا) ، وهو البعد ديل 8200 الكمبيوتر (ديل كمبيوتر ، جولة الصخرة ، تكساس) ، وpClamp 9 البرمجيات (الأجهزة الجزيئية).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
المعزولة إعداد الدماغ كله نوضح في هذا الفيديو يسمح تقييم الآليات الخلوية الكامنة وراء استثارة ونقل متشابك في الخلايا العصبية التي تم تحديدها ، بما في ذلك تلك الموجودة في مسارات معالجة حاسة الشم في الدماغ ذبابة الفاكهة الكبار (ودود يا قو ، 2006). هذا النهج هو مكمل لدراسة نشاط الخلايا العصبية في الدماغ من ذبابة الفاكهة سليمة الكبار (ويلسون وآخرون 2004 جميع) ، في معظم التسجيلات بنفس الطريقة من الخلايا العصبية في المخ لدى الثدييات شريحة مكملة لتسجيلات مستيقظا في الثدييات التصرف. هناك اثنين من المزايا الرئ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة لمنح NS27501 DKOD. وقدمت دعما إضافيا لهذا العمل من قبل برنامج المنح HHMI أستاذ لDKOD.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| #5 ملاقط | أداة | Fine Science Tools | رقم 11251-10 | كن حذراً، ولا تتسبب أبداً في إتلاف الأطراف الدقيقة للملاقط. |
| باباين | كاشف | Worthington Biochemical | 3126 | ٢٠ وحدة/مل مُنشّط بـ ١ ملي مولار من L-cysteine |
| مجهر تشريحي | طراز SMZ-2B: C-PS | أجهزة Nikon | مجهزة بمصابيح ألياف بصرية ذات عنق إوزة مثبتة بزاوية منخفضة | |
| إبرة &محقنة | بريسيجن جلايد (PrecisionGlide)®، شركة Becton Dickinson | 305175 & 309602 | زهيدة الثمن ومتينة | |
| مجهر قائم | Axioskop2 FS plus | Carl Zeiss, Inc. | مزود بمنصة ثابتة، وعدسة شيئية غمر مائي بقوة تكبير 40X، وبصريات نومارسكي (Nomarski)، ومصباح فلوري. | |
| مضخم تثبيت الرقعة (Patch clamp amplifier) | ٢٠٠ ب | Molecular Devices | ||
| محول Digidata من رقمي إلى تماثلي | 1322أ | Molecular Devices |
المراجع
- Gu, H., O Dowd, D. K., K, D. Cholinergic synaptic transmission in Adult Drosophila Kenyon cells in situ. Journal of Neuroscience. 26, 265-272 (2006).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe. Science. 303, 366-370 (2004).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
