高效率转导肝癌细胞的重组腺相关病毒血清型3载体

Summary

在这篇文章中，我们描述了鉴定的腺相关病毒血清型3（AAV3）针对人肝癌细胞的最有效的载体。

Abstract

重组载体的非致病性的人类细小病毒，腺相关病毒（AAV2）已经开发，目前正在使用的基因治疗临床试验。最近，一些额外的腺相关病毒血清型也被孤立，这已显示出各种小型和大型的动物^模型 1的选择性组织向性。 10个最常用的腺相关病毒血清型，AAV3是目前效率最低的，在体外以及体内转导的细胞和组织。

然而，我们最近发表的研究报告，我们已经证明AAV3载体转导人肝癌 - 肝母细胞瘤（HB）和肝细胞癌（HCC） - 细胞株非常有效，因为AAV3利用人肝细胞生长因子受体细胞作为有约束力的共同受体并在这些细胞中的^条目 2,3 。

在这篇文章中，我们描述，以实现高效率的重组AAV3携带报告基因的载体转导人肝癌细胞所需的步骤。重组AAV3携带治疗基因的载体的使用，最终可能导致潜在的人类基因治疗肝癌。

Protocol

1。重组腺相关病毒血清型3（rAAV3）载体的包装

1. 前往网站:" http://www.geguchadze.com/calc "的DNA计算的金额。
2. 预混合腺病毒辅助质粒pHelper，pACG2c3（AAV的辅助）和pdsAAV - CB - EGFP在中期（rAAV载体）没有FBS和抗生素。总成交量应该是8750μL十个15厘米²板。
3. 添加到DNA在步骤1.2中的解决方案直接裴1250μL（0.1％M / V，Polysciences，CAT＃23966，pH值4.5）。旋涡几秒钟的DNA - PEI的解决方案。
4. 孵育DNA - PEI在室温（RT）5分钟，形成一个复杂的解决方案。
5. 加入1毫升的DNA - PEI解决方案，每15厘米²板。
6. 4小时后取出的媒介，与25毫升新鲜的完全培养基代替10％胎牛血清（C型DMEM）。
7. 72个小时，转染后，刮去的细胞，倒入250 mL锥形离心管。
8. 在3000转的自旋，在4 ° C为10分钟。倒掉上清液。
9. 重悬细胞沉淀在5毫升RB的TMS的缓冲液（50毫米的Tris - HCl，150 mM氯化钠，pH值8.0）。转移到一个新的15 mL锥形管。
10. 在干冰乙醇浴10分钟和解冻冻结在37 ° C为10分钟。重复三次。
11. 添加1μL4.8米氯化镁₂和2 BenzonaseμL（25 U /μL，Novagen公司，卡特彼勒＃70664-3）。涡和孵化在37 ° C为40分钟。
12. 在4000转离心，在4 ° 40分钟C和收集上清（澄清裂解液）。
13. 在13 mL快速密封的离心管（美国贝克曼，CAT＃342413），负载碘克沙醇从上到下的渐变（OptiPrep，CAT＃1114542）:2毫升，15％，25％的2毫升，1.5毫升40％ 1.5毫升60％的碘克沙醇。碘克沙醇梯度顶部加载的上清（步骤1.12）。填写与Rb TMS的缓冲液管。
14. 在75000转速为1小时离心机在16℃使用贝克曼90Ti转子。
15. 通过插入一个注射器在40-60％的边界，收集40％的碘克沙醇分数。
16. 在一个50 mL锥形管传输40％的碘克沙醇的一小部分，并用缓冲液40毫升（20毫米的Tris，15 mM氯化钠，pH值8.5）。
17. 组装的过滤装置，使用HiTrap Q惠普柱（通用电气医疗集团，卡特彼勒＃17-1154-01）。以下缓冲区清洗列:25缓冲液（20毫米的Tris，15 mM氯化钠，pH值8.5）; 25毫升缓冲液B（10毫米的Tris，500 mM氯化钠，pH值8.5）; 50 mL缓冲液A中; 40毫升病毒样本的一个缓冲区中，缓冲区50毫升（20毫米三，15毫米氯化钠，pH 8.5）; 20毫升缓冲液C（20毫米，175毫米氯化钠，pH值8.5三）;
18. 收集彗星在20毫升阿波罗集中（轨道Biosciences公司）的缓冲区。 4，在3000转离心° C为10分钟。
19. 丢弃的流量通过，并添加20毫升的冰鲜PBS离心3000转，在4 ° 10分钟的彗星。
20. 丢弃的流量通过，并添加500μL冰鲜PBS。洗净载体膜转移到硅处理的Eppendorf管中，并存储在小分装冷冻于-80 ° C。

2。 rAAV3矢量滴度测定

1. 解冻10μL纯化的Eppendorf管中冰病毒。加入_{40μL2 O} DDH
2. 新增的Benzonase 0.2μL（25 U /μL，Novagen公司，CAT＃70664）和37 °为1小时。
3. 取50μL质粒在另一Eppendorf管（0.2纳克/μL）的标准。
4. 添加在每个管，并在65 ° C孵育30分钟的100毫米NaOH 50μL。
5. 冰寒立即在冰上至少5分钟。
6. 切割转印膜（Millipore公司，卡特彼勒＃INYC00010）根据生物点滤纸（BIO - RAD，CAT＃1620161）。在10X SSC冲洗20分钟三滤纸膜。
7. 设置狭缝杂交SF器械（生物点，CAT＃170-6542）。连接到一个保温瓶，并添加100μL10倍SSC狭缝杂交仪。
8. 每个步骤2.5样品中加入100μL20X SSC和1μL6X样染料。
9. 膜在狭缝杂交装置装到每个样品100μL。
10. 添加到每个样品100μL，10倍SSC的另一个。
11. 重复步骤2.9和2.10，直到所有的样品通过膜。
12. 拆解狭缝杂交仪器和删除膜。放入督察连接器SL - 1000型紫外交联剂。打开"能源"，"最佳交联"（显示1200），推动"开始"。
13. 煮沸1毫升（SS）的鲑鱼精子DNA（费舍尔，CAT＃NC9753983）为5分钟。冰浴至少5分钟。
14. 准备预杂交液混合DDH _{2 O} 15毫升27.5毫升20X SSC，50X登哈特的解决方案的5毫升1.25毫升的20％SDS，波利亚和0.25毫升，1毫升的SS DNA步骤2.13。
15. 暂停在预杂交液25毫升在上限的玻璃圆筒，在65 ° C过夜杂交室孵育膜。
16. 稀释10μLDDH ₂ O的50纳克的DNA模板。熬在100 ° C下5分钟，冷却至少5分钟，立即在冰上。
17. 在1分钟在室温下3000 rpm的离心机。新增10毫米3 dNTPs 2μL的（缺乏dCTP），2μLHexanucleotide混合（罗氏，CAT＃11277081001），1μL的Klenow酶（罗氏，CAT＃11008404001）和^5μLα-32 P - dCTP。在37 ° C下10分钟。
18. 离心2分钟3000转的G - 50柱（通用电气医疗集团，卡特彼勒＃27-5330-01）。步骤2.17负载探头入列。在2分钟3000转离心收集流过。
19. 计数放射性。在100℃，5分钟，立即冰浴至少5分钟，煮探头。
20. 添加到预杂交液与膜探针（6x10 ⁵ CPM /毫升）。
21. 在65 ° C孵育过夜杂交室。
22. 倒掉杂交液和冲洗2X SSC +0.1％SDS的膜在室温为15分钟。
23. 丢弃的解决方案，并在65℃30分钟冲洗膜在0.1倍SSC 0.1％的SDS。
24. 弃掉的解决方案，在0.1倍SSC冲洗膜在室温下简要。
25. 6小时暴露于-80 ° C的电影和发展电影。一个典型的结果是如图1所示。

3。 rAAV3载体介导的转导人肝癌细胞的转基因表达

1. 种子1 × 10 ⁴细胞（或者Huh7肝癌或Hep293TT）在每孔96孔板。在加湿的CO ₂培养箱孵育至少18小时。
2. 从96孔板介质。
3. 洗涤细胞两次中等50μL没有FBS和抗生素，并删除。
4. 添加50μL介质没有在5000 VGS /细胞的FBS和抗生素和rAAV载体。
5. 板块中的CO ₂培养箱孵育4小时。
6. 丢弃的介质。 50μL完全培养基洗涤细胞两次删除。
7. 每孔加入150μL的C - DMEM孵育板中的CO ₂培养箱中培养72小时，并可视EGFP的表达，用荧光显微镜（DMI 4000B;莱卡微系统） 。
8. ImageJ分析软件（美国国立卫生研究院，美国马里兰州贝塞斯达，的），从三个井病毒感染的细胞图像定量分析。
9. 转基因表达被评定为总面积的绿色荧光（像素^2）每视野。一个典型的结果如图2所示。
10. 流式细胞仪检测转基因表达，也可以。

4。代表性的成果:

上文所述的协议，可以有效地生成腺相关病毒血清型载体。典型的产量是500μL，含10月^11日 〜VGS /μL，纯化载体的股票。矢量股票的纯度是由比较DNA定量插槽印迹杂交信号，并没有Benzonase消化。有效地净化rAAV3载体转导人类肝癌 - 肝母细胞瘤（HB）和肝细胞癌（HCC） - 细胞株。

图1。DNA定量吸入印迹分析确定rAAV3载体滴度。纯化病毒库存，消化与Benzonase（上排）的2倍稀释， ^用 32 P标记EGFP特定DNA探针分析DNA定量槽杂交。 AAV3载体滴度由1纳克（中间行）或10毫微克（下排）装上膜的AAV - EGFP的质粒标准比较。这些数字对应的DNA拷贝。

图2重组腺相关病毒载体介导人肝癌细胞的转基因表达。 Hep293TT细胞，最近成立的人肝细胞线⁴条，无论是模拟感染（左图），或转5000 VGS /要么scAAV2 - EGFP或scAAV3 - EGFP载体的细胞在37 ° C， 2小时。转基因表达的转导后72小时可视化使用荧光显微镜。

Discussion

非致病性人类细小病毒，腺相关病毒（AAV）为基础的重组载体已发展起来的，目前在基因治疗^临床试验5使用。此前，10个最常用的腺相关病毒血清型，一般的AAV3载体的转导效率已报道在体外 ^和体内1，要特别低。然而，我们最近的观察，AAV3载体转导人肝癌细胞系得非常好，决定由流式细胞^仪 2定量，AAV3利用人肝细胞生长因子受体（hHGFR的细胞作为一个具有约束力，并在这些条目的共同受体）细胞^3，强烈建议，特别是有选择性的AAV3组织，嗜在一般人的肝细胞，人肝癌细胞。然而，由于AAV3载体，也有效地转导人体正常^肝细胞2， 其在体内的癌基因治疗中的应用潜力将受到负面影响。一个可能的策略来规避这种潜在的问题涉及转录针对癌细胞通过确定一个基因的产物，是有选择性的肿瘤产生，但不正常的肝细胞。例如，以往的研究表明，血清α-甲胎蛋白（AFP）作为一个跟踪的存在，进展和/或某些类型的肝癌再次发生的具体标记，因为正常的肝细胞产生极少量的一般这种蛋白质。事实上，我们已经使用了AAV3含AFP启动，目标在肝癌细胞中的转基因表达的载体，但不是在正常的肝细胞，研究目前正在进行中，测试了肝癌的小鼠移植瘤模型这种方法的疗效。在我们进一步的研究中，我们所观察到的表面^暴露在6-14病毒衣壳蛋白的酪氨酸残基的定点突变，不同的腺相关病毒血清型载体转染效率可显着增强。自6 7表面暴露的酪氨酸也AAV3保守，我们这些残余物的定点诱变和酪氨酸突变AAV3载体的转导效率明显增强人肝癌细胞（未发表数据）。研究目前正在进行评价其安全性和酪氨酸突变AAV3载体在小鼠移植瘤模型，为人类肝母细胞瘤和肝细胞癌的疗效，如果成功的话，最佳的酪氨酸突变AAV3血清型载体可能被证明是针对人体肝脏为潜在的基因治疗的癌症。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Cellgro	10-0170CM
PEI	Polysciences， Inc.	23966
Benzonase	Novagen， EMD Millipore	70664-3
HiTrap Q HP 色谱柱	GE Healthcare	17-1154-01
鲑鱼精子 DNA	Fisher Scientific	NC9753983
碘沙醇梯度	OptiPrep	1114542
G-50 色谱柱	GE Healthcare	27-5330-01