Summary
مظاهرة للتصنيع واستخدام إلكترود شفط خارج الخلية المستخدمة لقياس التسجيلات الكهربية من الحبال القوارض الولدان الشوكي
Abstract
يمكن دراسة وضع circuitries العصبية وتنقل القوارض باستخدام الحبل الشوكي الولدان مولد النمط المركزي (CPG) السلوك. نحن يبرهن على وجود طريقة لصنع أقطاب الشفط التي يتم استخدامها لفحص النشاط CPG ، أو تنقل الوهمية ، وحبال القوارض تشريح العمود الفقري. توضع الحبال القوارض في السائل النخاعي الشوكي الاصطناعي ويتم رسمها جذور بطني في القطب الشفط. هي التي شيدت من قبل القطب الكهربائي تعديل شفط متاحة تجاريا. يستخدم سلك أثقل الفضة بدلا من الأسلاك القياسية التي قدمها القطب متاحة تجاريا. يتم استبدال الزجاج على طرف القطب التجارية مع طرف من البلاستيك لزيادة المتانة. نحن نستعد جهة أقطاب كهربائية المرسومة ، والمصنوعة من أحجام محددة من الأنابيب ، مما يسمح للاستنساخ والاتساق. يتم جمع البيانات باستخدام مكبر للصوت والبرمجيات neurogram الاستحواذ. تجرى التسجيلات على جدول الهواء داخل قفص فاراداي لمنع التدخل الميكانيكية والكهربائية ، على التوالي.
Protocol
يمكن التسجيلات الكهربية المعزولة من النخاع الشوكي تكشف التغيرات الجينية والتنموية إلى الدوائر العصبية 1. أثبتنا سابقا وسيلة لتشريح الحبال الفأر الشوكي الولدان 2. هنا نقدم طريقة لتحضير الأقطاب شفط مفيدة في تسجيل تنقل الوهمية في النخاع الشوكي معزولة 3.
ويمكن استخلاص غيض من القطب أنابيب بلاستيكية لنصيحة جيدة جدا من ناحية استخدام مصباح الكحول درجات الحرارة المنخفضة 3-5. يعقد أنابيب البلاستيك (PE90 ، كلاي ادامز Intramedic TM) على الشعلة لتليين الأنابيب في شكل مرن. كما أنابيب يبدأ في الذوبان ، وتصبح أكثر شفافة يتم إزالته من مصدر الحرارة ويتم سحبها بلطف ينتهي إربا. توقيت إزالة أنبوب من اللهب مهم لضمان عدم انهيار البلاستيك أو انقسام في حين يجري استخلاصها. يتم قطع جزء رقيقة من أنابيب بشفرة الحلاقة حسب قطرها الداخلي المطلوب ، وفقا لما تمليه عمر العينة أو على المستوى القطاعي للسلك. لسهولة مما يضع س الطوق على الأنابيب ، ويتم إجراء خفض 45 درجة في نهاية سميكة من أنابيب بشفرة حلاقة. يتم تثبيت الطويق وس الدائري في نهاية سميكة لنعلق غيض القطب إلى القطب برميل.
للسماح لأقطاب الحجم تحديدا وتجنب الصعوبات اليد سحب نصائح القطب ، يمكن بناؤها باستخدام أقطاب كهربائية صغيرة أنابيب إدراجه ضمن الأنابيب أكثر سمكا (PE90). أطوال الأنابيب محددة لمتطلبات الإعداد وتسجيل متغير. نقدم القياسات المستخدمة في تجاربنا 1-3،5. يتم قطع بطول 1cm من الأنابيب السليكوون غرامة (زيوس ، قطع صغير) وبطول 10cm من PE90 أنابيب بشفرة حلاقة. ينبغي فحص نهايات الأنابيب الصغيرة للتأكد من عدم سحقها أو مغلقة. ويمكن فتحها باستخدام دبوس الحشرات (أدوات العلوم الجميلة). يتم وضع قطرة من مادة لاصقة (JB ولد) على منتصف الأنبوب PTFE. يتم رسمها والسليكوون أنابيب لاصقة في أنابيب الشفط باستخدام PE90 الفم على أنابيب PE90. يتم إجراء خفض 45 درجة في نهاية سميكة من الأنابيب وأرفقت الطويق وس الدائري ، كما السابقة.
ومفكوك موصل BNC والطويق من القطب شفط التجارية. هي غارقة في موصل BNC الزيلين لمدة ساعة لإزالة الختم بالشمع. ثم يتم شطف موصل في مجال المياه والمجففة.
يجب أن يكون أقل مرفأ الجانب الزاوية على الجانب للبرميل. يتم تسخين قضيب معدني به ناسخ بنسن وضغطت في الحفرة الموجودة على الجانب للبرميل في زاوية منخفضة. يتم قطع بطول 15cm من الأسلاك الفضية 0.010 بوصة (AM الأنظمة) ، وغارقة في التبييض لمدة خمس عشرة دقيقة. يتم ذلك لإنشاء طلاء كلوريد الفضة التي تسعف في توصيل الإشارات 6. يتم شطف السلك بالماء ، والمجففة ، وملحوم ثم الى موصل BNC. تندس سلك موصل BNC والفضة في شفط برميل الكهربائي مع مساحة كافية للموصل BNC على البقاء إلى جانب برميل. يتم إدخال أنبوب الشفط بمنفذ الجانب 2 - 3cm. يتم حقن سيليكون مانع التسرب في برميل تقريبا 2 - 3cm. هي الخيوط موصل BNC في برميل من القطب دفع تسرب إلى الأمام.
هي الخيوط الآن غيض من القطب في الواجهة الأمامية للقطب. ويمكن أيضا تقليص الأنابيب يمكن ان تضاف الى تعزيز خط الشفط من ميناء الجانب.
الأقطاب الكهربائية هي التي شنت على micromanipulators التي تعلق على المدرجات المغناطيسي ، وضعت بالقرب من صحن التسجيل. وترد الكابلات المحورية BNC إلى أن headstage السلكية الى مكبر للصوت. يتم توصيل مكبر للصوت إلى محول (Polyview) التي متصلة إلى بطاقة التناظرية الرقمية (الصكوك الوطنية) في كمبيوتر PC مع برنامج الحصول على البيانات (Polyview).
عند تسجيل بيانات الكهربية ، فمن الضروري للقضاء على جميع أشكال التدخل الخارجي. يتم وضع الطبق التسجيل ، مكبر للصوت ، ومرحلة على رأس جدول الهواء داخل قفص فاراداي لمنع التدخل الكهربائية والميكانيكية ، على التوالي.
ممثل النتائج :
يمكن الرقم 1. تعديلها والشفط الكهربائي المتاحة تجاريا عن طريق إضافة الفضة أثقل قياس الأسلاك وتلميح البلاستيكية التي يتم رسمها على يد مصباح الكحول ، أو شيدت مع الأنابيب البلاستيكية ذات الأحجام المتوفرة تجاريا محددة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استبدال البارافين مع تسرب أكثر دواما سيليكون مانع التسرب يسد.
الشكل 2. تخطيطي من القطب شفط بالنسبة الى طاولة الهواء (للعزلة الميكانيكية) ، قفص فارادي (الكهربائية isolatiفي) ، ومكبر للصوت الكمبيوتر. تجدر الإشارة إلى أن هناك أرضية الصحن المشار إليه وتسجيل الأرض الثانية التي يتم الرجوع إلى طاولة الهواء وقفص فاراداي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمكن دراسة تطوير النظام العصبي باستخدام الحبال القوارض معزولة الشوكي. في وجود العصبية ، ويمكن أن تتولد تنقل الوهمية من الحبل الشوكي في شكل من أشكال النشاط الكهربائي 1،3 منقوشة. ويتم إنتاج هذه الدفقات الإيقاعية في 0،2-0،5 هرتز ومنقوشة في التناوبات بين اليسار واليمين والمثنية الباسطة. في مراحل النمو المختلفة ، ومتانة وأنماط هذا النشاط يختلف 1. الطفرات الوراثية يمكن أن تخل أيضا من هذا النشاط الزخرفة 3،5،7. دراسات المعدلة وراثيا والتنموية لهذا النشاط توفير نظرة ثاقبة لتنظيم الدوائر المركزية نمط توليد وتبلغ دراسات التنمية العصبية ، عموما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
صامويل فاف وهو أستاذ في مختبرات التعبير الجيني في معهد سالك للدراسات البيولوجية ومحقق في معهد هوارد هيوز الطبي. وأيد هذا العمل من قبل كريستوفر ودانا ريف مؤسسة. قدم جو Belcovson ، Schnoeker كينت ومايك سوليفان في الموارد الوسائط المتعددة في معهد سولك المساعدة في التصوير والتحرير.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE Sub Lite Wall Tubing (Small tubing) | Zeus | 36AWG | 0.005”ID x 0.003” Wall (Small Parts) Also available in 0.003” to 0.006” |
| Large tubing (0.86mm (0.34”)) | BD Biosciences | 427420 | 0.86mm (0.34”) O.D. 1.27mm (.050”) |
| Electrode Barrel | A-M Systems | 573000 | |
| Adhesive | JB Weld | ||
| Adhesive: Silicone caulk | |||
| Solder and soldering iron | |||
| Bleach | |||
| Xylene | |||
| Silver wire: 0.010” | A-M Systems | ||
| Insect pins: Austerlitz 0.1mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Magnetic Stand | Narishige International | GJ-8 | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN 151 | |
| Miniboard (Headstage) | Grass Technologies | F-15EB/B1 | |
| Polyview Adaptor Unit | Grass Technologies | PVA 8 | |
| Bipolar Portable Physiodata Amplifier System | Grass Technologies | 15LT | |
| ANALOG TO DIGITAL CARD | National Instruments | 6035E | |
| Air Table; Vibraplane | Kinetic Systems |
References
- Gallarda, B. W., Sharpee, T. O., Pfaff, S. L., Alaynick, W. A. Defining rhythmic locomotor burst patterns using a continuous wavelet transform. Ann N Y Acad Sci. 1198, 133-139 (2010).
- Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W.
- Gallarda, B. W. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, 233-236 (2008).
- Landmesser, L. The development of motor projection patterns in the chick hind limb. J Physiol. 284, 391-414 (1978).
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Chanin, M. The determination of chloride by use of the silver-silver chloride electrode. Science. 119, 323-324 (1954).
- Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).
