يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

اشتقاق خطوط التوتة تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية من أجهزة الصراف الآلي -- / -- و البروتين p53 -- / -- الفئران

11.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/2598

⸱

أبريل 3, 2011

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Cornell University

في هذه المقالة

ملخص

نوضح في هذا الفيديو بروتوكولاً لإنشاء خطوط خلوية من سرطان الليمفوما التيموسية لدى الفئران. ومن خلال اتباع هذا البروتوكول، نجحنا في إنشاء العديد من خطوط الخلايا التائية من فئران Atm-/- و p53-/- المصابة بسرطان الليمفوما التيموسية.

الملخص

تعد الخطوط الخلوية المستقرة أداة بحثية بالغة الأهمية يمكنها تقليل استخدام الحيوانات المختبرية في الأبحاث. تظهر بعض سلالات الفئران المعدلة وراثياً، مثل Atm-/- و p53-/-، ليمفوما تيموسية بشكل مستمر في مرحلة مبكرة من الحياة 1,2، وبالتالي، يمكن أن تكون مصدراً موثوقاً لاشتقاق خطوط الخلايا التائية الفأرية. نقدم هنا بروتوكولاً مفصلاً لتطوير خطوط مستقرة من الخلايا التائية لليمفوما التيموسية الفأرية دون الحاجة إلى إضافة الإنترلوكينات كما هو موضح في البروتوكولات السابقة 1,3. تم حصاد الأورام من فئران تتراوح أعمارها بين ثلاثة إلى ستة أشهر، عند ظهور أولى المؤشرات المرئية للأورام بناءً على ملاحظة الوضعية المقوسة، وصعوبة التنفس، وضعف العناية بالمظهر، والهزال في السلالات القابلة للإصابة 1,4. لقد نجحنا في إنشاء عدة خطوط من الخلايا التائية باستخدام هذا البروتوكول وسلالات نقية من فئران Atm-/- [FVB/N-Atmtm1Led/J] 2 و p53-/- [129/S6-Trp53tm1Tyj/J] 5. ونوضح كذلك أن أكثر من 90% من تجمعات الخلايا التائية المستقرة تعبر عن CD3 و CD4 و CD8. واتساقاً مع الخطوط الخلوية المستقرة، فقد تم تمرير الخلايا التائية الناتجة عن استخدام البروتوكول الحالي لأكثر من عام.

البروتوكول

1. تشريح الأورام

  1. لتشريح الورم ، يتم وضع منشفة ورقية نظيفة أو ثنى الجراحية المتاح على لوحة التشريح ورشها مع الايثانول 70 ٪.
  2. يصرح باستخدامها بشكل روتيني الفئران لهذا البروتوكول مع CO 2. ضع الماوس الموت الرحيم على منصة التشريح ورذاذ جانبي الحيوان مع الايثانول. يقام الماوس في مكان على منصة التشريح باستخدام دبابيس دفع أربعة أو أكثر من خلال إدراج الساقين ورشها جيدا مع الايثانول 70 ٪.
  3. يتم قطع الجلد فوق العانة من خط الوسط الى قاعدة الرأس باستخدام مقص العقيمة ، مع تجنب عضلات الكامنة واختراق في تجاويف الجسم.
  4. فتح التجويف البطني مع زوج جديد من مقص وملقط معقم والحرص على عدم الاضرار الأعضاء الداخلية.
  5. فتح التجويف الصدري عن طريق تشريح وتنحرف القفص الصدري للكشف عن الورم ، دون الأوعية الدموية المدمرة.
  6. تبقى منفصلة الورم من الأجهزة الأخرى ، ونقل قطعة حوالي 40-50 ٪ من الورم الكلي (تقريبا ما يصل الى 1.5 X 0.8 X 0.8 سم) في برنامج تلفزيوني الباردة على الجليد.
  7. يمكن حفظ الجزء المتبقي من الورم لفحوصات أخرى ، ويمكن إجراء التشريح الكامل في هذا الوقت.

2. زراعة خلايا الغدد اللمفاوية

  1. رذاذ الأنبوب الذي يحتوي على الورم مع تشريح الإيثانول 70 ٪ ونقلها إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
  2. إضافة 10 مل من المتوسط ​​لثقافة عقيمة طبق بيتري 150 مم 2.
  3. نقل قطعة من ورم في طبق بتري عن طريق الشفط لطيف مع ماصة.
  4. منحنى اثنين العقيمة إبرة قياس 18 التي تواجه الجانب مشطوف بها.
  5. فصل الورم باستخدام الإبر عازمة.
  6. دوامة الطبق ، اضغط برفق ومكان في زاوية لجمع تعليق خلية إلى جنب ، مع تجنب القطع الكبيرة من الورم.
  7. نضح تعليق الخلية ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل مع تجنب القطع الكبيرة من الورم.
  8. غسل لوحة مع 10 مل من متوسطة ونقل في أنبوب نفس الوقت تجنب القطع الكبيرة من الورم.
  9. مزيج تعليق خلية مكونة من الخلايا الليمفاوية وخلايا انسجة بلطف ونقل 5 مل في دورق نسيج الثقافة T - 25 و 10 مل إلى T - 75 قارورة نسيج الثقافة. دوامة القوارير بلطف.
  10. تعليق استخدام الخلايا المتبقية لجعل 2 و 4 و 10100 و 1000 التخفيفات أضعاف في حجم 2.5 مل النهائي (خلايا زراعة بكثافات مختلفة باستخدام عدة أنواع من السفن الثقافة يزيد من احتمال إنشاء خط T - الخلية).
  11. الصفيحة 2.0 مل من كل تخفيف في الآبار الفردية لوحة 6 - جيدا. دوامة بلطف لوحة.
  12. احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة في ترطيب الاجواء 2 أكسيد الكربون في الهواء.

3. تغذية الخلايا الليمفاوية

  1. بعد 48 ساعة من الحضانة ، إضافة 5 مل من المتوسط ​​إلى القارورة T - 25 و 10 مل من المتوسط ​​إلى القارورة T - 75 على طول الجدار مع الحد الأدنى من اضطراب في الخلايا.
  2. إضافة 2 مل من المتوسط ​​إلى كل بئر من لوحة 6 - جيدا على طول الجدار مع الحد الأدنى من اضطراب في الخلايا.
  3. احتضان خلايا لحاء 72 إضافية

4. الركض خلايا الغدد اللمفاوية

  1. الأولي مرور
    1. في نهاية اليوم الخامس من الحضانة ، وpassaged الخلايا في نسبة 1:1 ، مع الحفاظ على القوارير واللوحات الأصلية (الحفاظ على كثافة خلايا بتركيز حوالي مل / 3x106 خلال الممرات first يعزز النجاح في إنشاء استمرار خط الخلية).
      1. للقارورة T - 25 ، ونقل 5 مل تعليق خلية في قارورة جديدة تحتوي على 5 مل من المتوسط. إضافة 5 مل من المتوسط ​​في قارورة الأصلي.
      2. للقارورة T - 75 ، ونقل 10 مل من تعليق خلية في قارورة جديدة تحتوي على 10 مل من المتوسط. إضافة 10 مل من المتوسط ​​في قارورة الأصلي.
      3. لوحة 6 - جيدا ، ونقل 2 مل من تعليق خلية من كل بئر في الآبار المماثلة من لوحة جديدة تحتوي على 2 مل من المتوسط ​​في كل بئر. إضافة 2 مل من المتوسط ​​في كل بئر من آبار الأصلي.
    2. احتضان جميع القوارير واللوحات ل72 ساعة إضافية في تجربتنا وضعت معظم خطوط الخلية من هذه إحدى الفقرات الثقافات (وجود مجاميع فضفاضة ملتصقة الخلية تعليق على خلايا انسجة المرفقة مؤشرا مبكرا على خط خلايا المنشأ).
    3. لثقافات مع أقل أو لا تعليق خلية المجاميع ملتصقة فضفاضة ، وإطعام قوارير أو من خلال استبدال اللوحات بعناية ما يقرب من 50 ٪ من المتوسط ​​في كل ساعة 72 لتجنب إزالة الخلايا من الثقافة الأصلية ، ويتم ترك السفن ثقافة دائمة ودون عائق ما لا يقل عن 5 دقائق للسماح للخلايا الرواسب في قاع بواسطة الجاذبية قبل التطلع لطيف لطاف المتوسطة.
  2. الحفاظ على خطوط الخلايا المنشأ
    1. وpassaged خطوط الخلايا أنشئت في قوارير جديدة والصفائح. لT - 25 و T - 75 قوارير ، إضافة 5 مل من النسخة الأصلية أوتعليق إحدى الفقرات في 5 مل من المتوسط. لمدة 6 - جيدا لوحات ، أضف 3 مل من التعليق الأصلي أو مرور خلية واحدة إلى 7 مل من المتوسط ​​في قارورة T - 25. الأعلاف والاحتفاظ الأصلي أو المرور من خلال استبدال ثقافة واحدة حجم إزالة مع مستنبت الطازجة.
    2. أنشئ ممر خطوط الخلايا في قوارير T - 25 الجديدة. خطوط الخلية وقتا مضاعفة 18-24 ساعة. يتم الاحتفاظ بصورة روتينية الثقافات في كثافة مل / 1 - 3x106 وpassaged كل 3 أيام. إضافة الحجم المطلوب من الثقافة السابقة لمرور متوسطة جديدة لجعل ما يصل الى 10 مل. الأعلاف والإبقاء على الثقافة الأصلية.
    3. بعد بضع فقرات ، فإن الخلايا غير ملتصقة مصيره دون دعم خلايا انسجة ملتصقة وتنفذ عددا أقل من الخلايا الملتصقة مع بعضها عبر الممر. بعد هذه النقطة ، يمكن الحفاظ على الثقافات في نسيج الثقافة غير المعالجة T - 25 قوارير.

5. تجميد واستعادة خطوط خلية ورم الغدد اللمفاوية

  1. يتم تجميد خطوط الخلية الطازجة في المتوسط ​​1640 RPMI تحتوي على 20 ٪ و DMSO FBS 10 ٪.
  2. وطرد الخلايا من ثقافة قديمة في 48 ساعة T - 25 قارورة (حوالي 1.5x10 6 خلية / مل) في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد التخلص من طاف ، هي الخلايا إعادة علقت في 2 مل من المتوسط ​​تجميد الباردة. يتم وضع اثنين من 1.0 مل من حجم الخلية تعليق من كل قارورة في قنينات تجميد وتجميدها على الفور عند -80 درجة مئوية ، ونقل إلى النيتروجين السائل في اليوم التالي.
  3. وتسترد الخلايا من تخزين النيتروجين السائل بواسطة ذوبان سريع ، وإعادة التعليق على محتويات في 10 مل من المتوسط ​​ثقافة جديدة. بدلا من ذلك ، يتم غسل الخلايا إذابة طازجة مرة واحدة في مستنبت دافئ لإزالة DMSO قبل إعادة التعليق في 10 مل من المتوسط ​​ثقافة جديدة. يتم استزراع الخلايا على الأقل قبل مرور 72 ساعة لاحقة.

6. ممثل النتائج

جهاز الصراف الآلي -- / -- تي خلية الخط تطويرها باستخدام هذا البروتوكول ، وعينت DWJ - ATM - 1 تميزت تلطيخ المضادة للCD3 - FITC ، APC - المضادة والمعادية للCD4 CD8 PE وتحليل تدفق الخلوي (Figure1). وكان أكثر من 90 ٪ من الخلايا T - CD3 ، CD4 و CD8 الثلاثي إيجابية.

الشكل 1
الشكل 1. توصيف خط تي خلية تم تطويرها باستخدام هذا البروتوكول.

علامات سطح الخلية من جهاز الصراف الآلي المنشأة -- / -- خط الخلية المعينة تميزت DWJ - ATM - 1 بواسطة تلطيخ المضادة للCD3 - FITC ومعاداة CD4 - APC ، ومكافحة CD8 - PE وتدفق تحليل الخلوي. لفترة وجيزة ، تم غسلها 1X10 6 خلايا جديدة مرة واحدة في برنامج تلفزيوني الباردة (1500 دورة في الدقيقة / 5 دقائق) ، وحضنت في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة مع 200 ميكرولتر من الكوكتيل الأضداد (الأجسام المضادة في كل 1:200 التخفيف في برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة 1 ٪. يمكن فحص الخلايا على الفور في حين تعد الخلايا الثابتة طازجة أو ثابتة لتحليلها لاحقا. بواسطة الفورمالين محايدة مضيفا مخزنة في نهائي تركيز 4 ٪ (المجلد / المجلد) وحضنت في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، تحصد بواسطة الطرد المركزي (1500 دورة في الدقيقة / 5 دقائق) ومعلق في 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة 1 ٪. تم تحليل ما مجموعه 1 4 10 X الخلايا باستخدام FACS Calibur دينار بحريني ومحلل البرمجيات CellQuest دينار بحريني (العلوم البيولوجية ، وسان خوسيه ، كاليفورنيا).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نقدم في هذا البروتوكول إجراءات مفصلة لإنشاء خطوط خلايا تائية فئرانية من نمطين جينيين مختلفين من الفئران؛ Atm-/- [FVB/N-Atmtm1Led/J] و p53-/- [129/S6-Trp53tm1Tyj/J]. وباستخدام هذا البروتوكول، تم في مختبرنا إنشاء ما مجموعه 6 خطوط خلايا تائية فئرانية Atm-/- (من أصل 7 محاولات) وثلاثة خطوط p53-/- (من أصل 5 محاولات). وتؤكد البيانات التمثيلية التي توضح أن خط الخلايا DWJ-Atm-1، وهو خط خلايا Atm-/-

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يود المؤلفون شكر الدكتور Boris Reizis من قسم الميكروبيولوجيا والمناعة في جامعة كولومبيا على المناقشات المفيدة. كما نود شكر الدكتورة Margaret Bynoe، والدكتور Rodman Getchell، وDeequa Mahamed من قسم الميكروبيولوجيا والمناعة في كلية الطب البيطري بجامعة كورنيل على المساعدة التقنية في قياس التدفق الخلوي، وLu Huang للمساعدة في تحرير الفيديو. كما يتوجه المؤلفون بالشكر لأعضاء مختبري Duhamel وWeiss على مراجعتهم النقدية للمخطوطة وإنتاج الفيديو، وStephanie Yazinski من مختبر Weiss لتربية وتنميط جيني للفئران p53-/- . أُجريت التجارب على الحيوانات وفقًا للإرشادات واللوائح التي وضعتها لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة كورنيل. تم دعم هذا البحث جزئيًا من خلال أموال مقدمة من وزارة الزراعة الأمريكية، خدمة البحوث والتعليم والتوسع التعاوني بين الولايات، برنامج بحوث صحة وأمراض الحيوان (إلى G.E.D. وR.S.W.) ومنح NIH رقم R03 HD058220 وR01CA108773 (إلى R.S.W). تم إنتاج الفيديو باستخدام المرافق الداخلية من قبل موظفي مختبري Duhamel & Weiss.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قائمة غير مرتبة><قائمة العناصر>وعاء ثلج<لي>إيثانول بتركيز 70%<قائمة>لوحة تشريح تتكون من كتلة رغوية مغطاة برقائق الألومنيوم ودبابيس<قائمة>مجموعتان من المقصات والملاقط الصغيرة المعقمة<لي>معقم 150 مم2 طبق بتري (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; رقم الكتالوج 08-757-13)<لي>إبر معقمة بقياس 18 (18 gauge)<قائمة>أنابيب مخروطية سعة 50 مل (Corning Inc.، كورنينج، نيويورك؛ رقم الكتالوج 430829)<قائمة>فورمالين مُنظم بنسبة 10%<لي>دوارق زراعة الأنسجة <قائمة غير مرتبة><قائمة>T-25 (TPP، تراسادينجين، سويسرا؛ رقم الكتالوج 90025)<لي>T-75 (شركة TPP، تراسادينجن، سويسرا؛ رقم الكتالوج 90075)<قائمة>أطباق ذات 6 عيون (Corning Inc., Corning NY; رقم الكتالوج 3506)<قائمة>محلول ملحي منظم بالفوسفات معقم برقم هيدروجيني 7.2 (PBS)<لي>وسط استنبات <قائمة غير مرتبة><لي>وسط RPMI 1640 يحتوي على 25 ملي مولار من HEPES، و200 ملي مولار من L-glutamine (شركة Lonza، ووكرسفيل، ماريلاند؛ رقم الكتالوج #12-115F)، مُدعم بما يلي:<قائمة غير مرتبة><قائمة>%10 مثبط حرارياً (56°ج، 30 دقيقة) مصل جنين البقر (FBS؛ شركة Hyclone، لوجان، يوتا؛ رقم الكتالوج SH30088.03)<قائمة العناصر>1% بنسلين وستربتومايسين (Mediatech, Manassas,VA; cat# 30-002-CI)<لي>1% أحماض أمينية غير أساسية (Mediatech؛ رقم الكتالوج 25-025-CI)<قائمة>٥٥ مللي مولار ٢βميركابتـو–إيثانول (Sigma, St Louis, MO; cat#M752)<قائمة>ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO؛ Calbiochem، La Jolla، CA؛ رقم الكتالوج 317275)<قائمة>الأجسام المضادة (eBioScience, San Diego, CA)<قائمة غير مرتبة><لـ>anti-CD3-FITC (رقم الكتالوج 11-0031-85)<لي>anti-CD4-APC (رقم الكتالوج #17-0041-83)<لي>anti-CD8-PE (رقم الكتالوج 12-081-85)<قائمة>ألبومين المصل البقري (BSA; Life Technologies, Grand Island, NY; رقم الكتالوج 11018-017)<قائمة>كونكانافالين أ (Sigma رقم الكتالوج C5275)<لي>أنابيب تجميد سعة 1.8 مل (Nunc، Roskilde، الدنمارك؛ رقم الكتالوج 368632)

المراجع

  1. Barlow, C. Atm-deficient mice: a paradigm of ataxia telangiectasia. Cell. 86, 159-171 (1996).
  2. Elson, A. Pleiotropic defects in ataxia-telangiectasia protein-deficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 13084-13089 (1996).
  3. Kuang, X. Control of Atm-/- thymic lymphoma cell proliferation in vitro and in vivo by dexamethasone. Cancer Chemother Pharmacol. 55, 203-212 (2005).
  4. Browne, S. E. Treatment with a catalytic antioxidant corrects the neurobehavioral defect in ataxia-telangiectasia mice. Free Radic Biol Med. 36, 938-942 (2004).
  5. Jacks, T. Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice. Curr Biol. 4, 1-7 (1994).
  6. Chervinsky, D. S., Lam, D. H., Zhao, X. F., Melman, M. P., Aplan, P. D. Development and characterization of T cell leukemia cell lines established from SCL/LMO1 double transgenic mice. Leukemia. 15, 141-147 (2001).
  7. Sharma, V. M. Notch1 contributes to mouse T-cell leukemia by directly inducing the expression of c-myc. Mol Cell Biol. 26, 8022-8031 (2006).
  8. Maser, R. S. Chromosomally unstable mouse tumours have genomic alterations similar to diverse human cancers. Nature. 447, 966-971 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تعطيل جين ATMتعطيل جين p53حصاد الأورامزراعة الخلاياقياس التدفق الخلويتمرير الخلاياالمخزونات المجمدةCD3 CD4 CD8
اشتقاق خطوط التوتة تي خلية سرطان الغدد الليمفاوية من أجهزة الصراف الآلي -- / -- و البروتين p53 -- / -- الفئران
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.