Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Tek Hücre Transcriptome Analizi

Published: April 25, 2011 doi: 10.3791/2634
Automatic Translation
*1, *1, 1,2
1Department of Pharmacology, University of Pennsylvania, 2The Penn Genome Frontiers Institute, University of Pennsylvania
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Bu yazıda, sıçan primer nöronal kültürlerin ve sonraki transcriptome analizi Arna amplifikasyon kullanarak tek hücre hasat için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, herhangi bir hücre tipi için genellenememektedir.

Abstract

Birçok gen ekspresyon analizi teknikleri heterojen toplumlarda kültür doku homojenatlarında veya hücreleri hücreleri izole malzeme güveniyor. 1,2,3 durumda beynin hipokampus gibi bölgelerin her biri, farklı hücre türleri ile karmaşık bir düzen içeren farklı mRNA profilleri. Hücre popülasyonlarının arasında ve içinde moleküler farklılıklar içine derinlemesine bir soruşturma daha fazlası için tek hücre hasat yeteneği sağlar. Biz daha fazla işlem için hücre hasat için basit ve hızlı bir yöntem açıklanmaktadır. Genellikle elektrofizyoloji kullanılan Pipetler (aspirasyon kullanarak) bir ilgi hücre izole etmek için kullanılan ve moleküler biyoloji teknikleri herhangi bir sayı ile daha fazla işlem için elverişli bir Eppendorf tüp içine depozito. Bizim protokol dendritler hücre kültürü veya akut dilim bile tek tek hücrelerin hasat için modifiye edilebilir.

Ayrıca tek bir hücre izolasyonların büyük bir alt uygulama olarak Arna amplifikasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, ters transkripsiyon veya gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gibi diğer gen ekspresyon analizi teknikleri, alternatif olarak laboratuar tarafından geliştirilmiştir. 4,5,6,7,8 Bu teknik, doğrusal amplifikasyonu için sağlar polyadenylated RNA sadece malzeme femtograms ile başlayan ve antisens RNA mikrogram miktarlarda. Doğrusal amplifiye malzeme izole hücre transcriptome bileşenleri göreceli bolluk PCR üstel amplifikasyon daha doğru tahmin sağlar. Temel prosedür amplifikasyon iki tur oluşur. Kısaca, bir T7 RNA polimeraz promoter mRNA transkript oluşturulan çift zincirli cDNA içine dahil edilmiştir. Bir in vitro transkripsiyon geceleme (IVT) reaksiyon sonra T7 RNA polimeraz çift telli cDNA birçok antisens transkript üretir yapılır. Ikinci turda bu süreci tekrarlıyor ancak başlangıç ​​materyali bu yana bazı teknik farklılıklar ile antisense RNA. Amplifikasyon üç turda, ikinci turda tekrar standarttır. Genellikle, üretilen antisens RNA melezleşmiştir ve bir mikroarray tespit böylece biotinlenmiş nükleozid trifosfatlar kullanarak in vitro transkripsiyon reaksiyonu üçüncü turda yapılır. 7,8

Protocol

1. Hücre Kültürü

Bizim laboratuvar deneyleri için aşağıdaki primer nöronal sıçan hipokampal kültürler kullanır. Aşağıda bu hücre kültürleri nasıl oluşturulur ve bakımı için değiştirilmiş Banker protokol tanımlamaktadır. 9, tabii ki, bu hücre kültür teknikleri permütasyon ve kurulan herhangi bir yöntemi ayrıntılı bir numara sağlayan bir özel laboratuvar özel ihtiyaçlarına göre uyarlanmış sürekli sağlıklı hücre kaynağı uygun bir yerine olacaktır.

  1. Beş otoklavlanmış, yuvarlak, 12 mm lamelleri 35 mm çanak yerleştirilir, sonra su ile durulanır (hücre kültürü notu), 80 mikrogram / ml borat tamponu O / N Poly-D-Lizin (MW 70-150,000) ile kaplı borat tamponu O / N 1 mcg / ml Laminin ile kaplanır, sonra su ile tekrar durulanır. NG medya (Glikoz (0.6% w / v) ile desteklenen Earle Kullanıcı tuzları ve GlutaMAX, penisilin (100 U / ml), streptomisin (100 mg / ml), at serumu (10% v / v) MEM) eklendi ve yemekler. bir inkübatör (% 5 CO 2 ° 37 ° C) saklanır. PDL150/laminin izole nöronların bir tek tabaka olarak büyümek için bir substrat olarak hizmet vermektedir. Lamelleri kaplama iki hafta önce kadar kaplı olabilir.
  2. Kaplama gününde, embriyonik gün 18 sıçan hippocampi birincil nöronlar 100.000 hücre / ml süspansiyon 1.5 ml ekleyerek NG medya kaplanmıştır. Dört ila altı saat sonra kaplama, her biri 35 mm çanak 5 mM 0.75 mcL kirlenmesine neden olan herhangi bir glial hücrelerin büyümesini önlemek için sitozin beta-D-arabinofuranoside (ara-C) ile tedavi edilir. Yirmi dört saat sonra, kaplama medya Earle tuzları ve w / v şekeri% 0.6, 1 mM sodyum piruvat ve B27 ile takviye L-glutamin MEM değiştirildi. Hücreler süreçlerin tam gelişimini sağlamak için herhangi bir deneylerde kullanımdan önce en az iki hafta süreyle büyümeye izin verilir.

2. Hazırlanması Pipetler

Not RNases: deri, tükürük ve hatta nefes RNases ana kaynağı, RNA, aşağılamak enzimler. RNaz ücretsiz teknik örnek RNases ile kontamine hale gelir ve daha sonra düşmeye gelmez ki protokol bu noktadan itibaren uyulması zorunludur. Bu numuneleri ve reaktifleri işlerken her zaman numune veya reaktiflerin üzerinde konuşurken asla eldiven giyen ve steril pipet uçları ve tüpler yeni kutularını kullanarak içerir. Genellikle, RNA çalışmaları için özel olarak belirlenen değildir pipetler RNaz RNaz Away (Moleküler Bioproducts) gibi bir tedavi çözümü ile onları silerek dekontamine. Ancak bu tedaviler ile örneklerin bulaşmasını önlemek için de önemlidir bu yüzden, bu çözümler herhangi bir downstream enzimatik reaksiyonları inhibe eder.

  1. Otoklav 1,5 mm dış çapı (OD) cam pipetler.
  2. Bir mikropipet çektirmenin kullanarak, çektirme, filament, ve pipetler göre değişebilir elektrofizyolojik kayıtlar için uygun bir çapa pipetler çekin 10 delik boyutu hücre toplama ucu önce kırılmış olacağından çok önemli değildir.
  3. Pipetler dikkatlice ipuçları kalacaktır (ideal mikropipet bir kavanozda) tozsuz bir ortamda saklayın.
  4. Kontrollü bir moda ipucu kırmak için, bir elin parmakları arasında gergin bir kimwipe tutun ve çok kağıt 1 ila 2 kez arasında pipet ucu hafifçe fırçalayın. Açılış hedef hücre boyutu yaklaşık% 75-100 olmalıdır. İstediğiniz sonuca ulaşmak kadar bu adımı ayarlayın.

3. Hazırlanması Kültür, tüpler ve Mikroskop

  1. 1.7 ml Eppendorf tüpleri istenilen sayıda hazırlayın. Malzeme, tek bir hücre ilâvelerle ya da hasat malzemenin depolanması için başka bir çözüm için kullanılacak ise 2 PBS, ilk iplikçik tampon mcL ekleyin.
  2. Hasat için, bir micromanipulator ile donatılmış bir 40x objektif ile ışık mikroskobu gerekecektir. Esnek borular sahibinin uzak önde gelen bir pipet tutucu kullanın. Toplama sırasında pipet istenmeyen hareketini önlemek için sabit bir yüzeye yapıştırmayın boru. Boru sonunda, bir Luer-Lock bağlantısı ile 1 ml şırınga bağlı ve kullanıcılar arasında değiştirilebilir, böylece bir iğne takın.
  3. Lamelleri kullanıyorsanız, her seferinde bir lamel ile çalışır. Gerekirse, yeni bir 35 mm çanak * PBS veya medya içeren seçim tek bir lamel aktarın. Uzun hücreler kuluçka, daha sağlıksız olacak ve mRNA profilleri daha sağlıklı bir hücrenin sapma olacaktır. Bu onlarla çalışmıyor inkübatör tutarak diğer lamelleri hücrelerin sağlığını korumak için kritik öneme sahiptir. Kuluçka dışındaki hücrelerde mümkün olduğunca çabuk çalışın.

* Bizim kurulum gerçek çanak duvarları coversli doğru mikropipet doğru ilerlemesine izin vermek için çok yüksek olduğundan, 35 mm çanağı kapak kullanmak gereklidirs.

4. Hasat Hücreler

  1. Mikropipet mikropipet tutucuya sabitleyin. Yapıştırmayın mikropipet mikromanipülatörler eklemek için tutucu. 40x hedefi ayarlayın.
  2. Mikroskop sahnede çanak yerleştirin ve hasat için uygun hücrelerin bir bölge bulmak. Primer nöronal kültürlerin durumda, hücre komşularından çevreleyen hücreler ve / veya süreçlerin hasat önlemek için nispeten izole edilmelidir. MRNA transkript soma ve süreçler arasındaki nüfus somatik mRNA'ların ilgilenen varsa bu yüzden sadece, süreçleri ile soma kirlenmesini önlemek için dikkatli olmalıdır değişir. Görüş alanının merkezinde hasat istediğiniz hücreye yerleştirin.
  3. Mikromanipülatör mikropipet ışık yoluna çanak çözüm doğru ilerlemek için kullanın. Çözüm içine pipet indirin. Şırınga ile hafifçe üfleyerek bu noktadan itibaren pozitif basınç uygulayın. Mercekten gözden geçirin. Pipet görüş alanı içinde bir gölge gibi görünmelidir. Kaba odaklama düğmeleri kullanarak pipet ucu bakış ve odak alanı içinde olduğu kadar iyi hücrelerin düzlem üzerinde, pipet ucunun konumunu ayarlamak. Pipet delik boyutu çok büyük veya çok küçük ise bu noktada, bu şekilde değerlendirilmelidir. Uygulama hasat doğru delik boyutu bu noktada elde edilip edilmediğini belirlemek için yeteneği sağlayacaktır.
  4. Şimdi, pipet hücrelerin uçağa doğru ilerlemek. Ipucu toplamak için istediğiniz bölgede kırmak için neden çok acele gelişmiş değildir ki önemlidir. Bunu önlemek için kaba odak odak düzlemli, pipet ucu hücreleri mikromanipülatörler kullanarak doğru ilerleyen ÖNCE ilerlemek için kullanın. Hücreleri ve pipet ucu hem odak kadar hücrelerin yakın olduğunda, ince odak kullanın. Pozitif basınç uygulayarak lamel onları üfleme önlemek için hücrelerin uçağa ulaşmadan önce durdurun.
  5. Hasat istediğiniz hücre soma dokunmadan böylece pipet ucunun mikromanipülatörler kullanın.
  6. Hücre pipet girinceye kadar şırınga kullanarak, ağız yoluyla, nazik vakum uygulanır. Hücre pipet giren değilse lamel kalkana kadar, hücre ve aşağı doğru hafifçe yakın ucu taşımak.

5. Hücre kaydetme

  1. Mikromanipülatör hemen çözüm pipet yukarı ve dışarı taşımak için kullanın.
  2. Sahibinden pipet çıkarın.
  3. 1.7 ml Eppendorf tüp tek elle tutun ve hafifçe dibe doğru tüp tarafında pipet ucu kırmak. (0.1 ml işareti amacı.)
  4. Tüp içinde merkezli kırık ucu ile 1-3 ml şırınga pipet üst ağzına bağlı bir iğne takın. Hızla tüpünün içine sprey pipet çözümü zorlamak piston bastırın. Hücre pipet çok uç kalmalıdır ve bu hücrenin düzgün bir şekilde dışarı atmak için yeterli olmalıdır. Kapiller eylem pipet içine sıvı geri getirecek gibi herhangi bir sıvı tüpün iki ucu dokunma dikkatli olun.
  5. Bir masaüstü mikrofuge'de kullanarak tüp içeriği hızla aşağı spin ve hemen dondurmak (mağaza -80 ° C) veya daha fazla işlem için buz (tercihen) yer.

6. Arna Amplifikasyon

  1. 1 İlk iplikçik cDNA sentezi Tur:
    MRNA / cDNA hibritler oluşturun.
    1. Tek bir hücre toplama hacmi her 5 mcL için, aşağıdaki toplama tüpü (buz) 1x ekleyin. Reaksiyon, büyük toplama birimleri için (2x 10 mcL toplama birimleri, vb) kadar ölçeklendirilebilir. Hata pipetleme hesap toplama tüpleri sayısı artı% 10-20 aşağıdaki reaktifler çarpılarak bir ana karışımı oluşturun. Arna ampification prosedürü her bir sonraki reaksiyon için bunu yapın.
      • On Ice
      • 1.2 mcL dNTP (her biri 2.5 mM)
      • 2.4 mcL 5x İlk iplikçik tampon
      • 0.3 mcL T7-oligo (dT) astar (100 ng mcL /)
      • 1.2 mcL DTT (100 mM)
    2. Nükleaz ücretsiz su ile 10.25 mcL hacmi getirin. Pipet karışımı ve spin kısa bir mikrofuge'de.
    3. 70 5 dakika boyunca inkübe ° C mRNA herhangi bir ikincil yapısını bozabileceğinden. Hemen en az 5 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin.
    4. (Yine usta bir karışımını kullanarak) ekleyin:
      • 0.3 mcL RNasin (40 U / ml)
      • 0.45 mcL Üstsimge III (200 U / ml)
      • 1 mcL nükleaz ücretsiz su
    5. Pipet karışımı ve spin kısaca. 42 1 saat inkübe ° C
    6. 70 ° C'de 15 dakika süreyle Üstsimge inaktive inkübe edin. Bir sonraki adıma devam edin.
  2. 1. Tur İkinci iplikçik cDNA sentezi
    Sentezi o yardım etmek için mRNA / DNA hibrid mRNA kısmının RNA primerleri oluşturunf cDNA çift telli.
      • On Ice
      • 12 mcL ilk iplikçik reaksiyon için ekleyin:
      • 8 mcL nükleaz ücretsiz su
      • 7.5 mcL 5x İkinci iplikçik tampon
      • 0.75 mcL dNTP karışımı (her biri 2.5 mM)
      • 0.25 mcL DNA ligaz (10 U / ml)
      • 1 mcL DNA polimeraz I (10 U / ml)
      • 0.25 mcL Rnase H (2 U / ml)
      Pipetleme ile iyice karıştırın ve kısaca döndürün. 16 az 2 saat boyunca inkübe ° C.
    2. Ekle: 1 mcL T4 DNA polimeraz (5 U / ml). Pipetleme ve spin kısa bir süre karıştırın. 16 ° C'de 10 dakika daha inkübe
    3. 11 Yıkama 2 kez 500 mcL yerine 750 mcL ile 1 kez yıkama tamponu ile hafif değişiklikler ile üreticinin talimatlarına göre Qiagen MinElute kiti kullanılarak reaksiyon temizleyin. Nükleaz ücretsiz su elute.
    4. Speedvac veya etanol yağış kullanarak 2-4 mcL konsantre ol. Etanol yağış, glikojen, bir nükleik asit taşıyıcısı olarak hareket eder ve küçük miktarda DNA veya RNA presipite zaman kullanılır. Sodyum asetat, sodyum, yağış yardım DNA omurgasının negatif yük nötralize yardımcı olur. Bu rutin yağış için bir master miks yapmak için gerekli değildir.
      • 29 mcL DEPC su ekleyin
      • 2 mcL glikojen (5mg/mL)
      • 1 / 10 hacim (3 mcL) 3M Sodyum asetat
      • 2.5 hacimli (~ 250 mcL) soğuk% 100 etanol
      İyice karıştırın. Çökelme -80 ° C (30 dk. O / N).
    5. 4 20 dakika santrifüj ° C
    6. Süpernatantı ve pelet 800 mcL% 70 etanol ile yıkayın. Pipetleme veya aşırı tuz çıkarılması yardım vorteks tamamen ya da pelet yerinden emin olun.
    7. Başka bir 20 dakika Santrifüj 4 ° C 15-20 dakika boyunca kuru ve hava süpernatantı çıkarın.
    8. 4 mcL nükleaz ücretsiz su içinde süspanse edin. Mağaza -20 veya -80 ° C veya sonraki adıma devam edin.
  3. In vitro transkripsiyon 1. Tur (IVT):
    Çift telli cDNA dahil T7 organizatörü antisens RNA sentezlerler.
    1. Bu reaksiyon bir 20 mcL tepki yerine bir 10 mcL tartılır dışında üreticinin talimatlarına göre Ambion MEGAscript T7 kiti kullanılarak gerçekleştirilir.. 12 Bu oda sıcaklığında bu reaksiyon monte etmek ve montaj sırasında oda sıcaklığında tampon tutmak için şart. Buz ise tampona DNA hızlandırabilir. Buz kullanılmadığı zaman UTP'larının ve enzim karışımı tutun.
      • AT ODA SICAKLIĞI
      • Ince duvarlı PCR tüpü yeniden süspanse çift zincirli cDNA aktarın.
      • 4 mcL NTP mix her mM (18.75)
      • 1 mcL 10x reaksiyon tamponu
      • 1 mcL 10x enzim karışımı
    2. 37 az 14 saat inkübe ° bir termalcycler C (tercihen) veya inkübatör.
    3. Bu reaksiyon Speedvac veya etanol yağış kullanarak örnek konsantrasyonu iki farklı yöntem kullanılarak temizlenebilir. Bir kit kullanarak temizleme için bir standart fenol / kloroform ekstraksiyonu ile temizlemek için Yöntemi A. geçin, Yöntem B'ye geçin
    4. Yöntem A:
      1. Yıkama 2 kez 500 mcL yerine 750 mcL ile 1 kez yıkama tamponu ile bazı değişiklikler 13 ile üreticinin talimatlarına göre Ambion Megaclear kiti kullanılarak reaksiyon temizleyin. Elüsyon adım için, sütun merkezi, 70 ° C'de 10 dakika inkübe 50 mcL nükleaz serbest su ekleyin. 1 dakika 10.000 g dönerler. Taze bir tüp içinde tekrarlayın. Eluatlar birleştirin. Speedvac VEYA etanol yağış kullanarak 2-4 mcL örnek Konsantre.
      2. Etanol yağış için: Amonyum asetat, nükleik asit ile serbest nükleotidler co-yağış önlemede etkili, çünkü bu durumda sodyum asetat yerine kullanılır. Bu NTP downstream reaksiyonları inhibe IVT reaksiyon, kullanılan yüksek konsantrasyonu nedeniyle önemlidir.
        • 50 mcL DEPC su ekleyin
        • 2 mcL glikojen (20 mg / ml)
        • 0.6 hacimleri (37.2 mcL) 5M Amonyum asetat
        • 2.5 hacimleri (~ 180 mcL) soğuk etanol
      3. Çökelme -80 ° C (30 dk. O / N) .*
      4. 4 20 dakika santrifüj ° C
      5. Süpernatantı ve pelet 800 mcL% 70 etanol (nukleaz ücretsiz su) ile yıkayın. Aşırı tuz tamamen kaldırmak için pelet çıkarmak için emin olun.
      6. Başka bir 20 dakika Santrifüj 4 ° C
      7. Süpernatant ve hava kuru 15-20 dakika çıkarın.
      8. 4 mcL nükleaz ücretsiz su içinde süspanse edin pelet.
    5. Yöntem B:
      1. Alternatif olarak, bir standart fenol / kloroform ekstraksiyon Arna ile temizlenir.
        • 50 mcL DEPC su ekleyin
        • 2 mcL glikojen (20 mg / ml)
        • 0,6 hacimleri (37.2 mcL)5M Amonyum asetat
        • 1 hacim (98 mcL) fenol: kloroform: izoamil alkol 25:24:1 (pH 7,8-8,0 dengelenmiş)
      2. 15 saniye karıştırın. Bir masa üstü mikrosantrifüj yarım maksimum hız, 1.5 dakika boyunca santrifüjleyin. Soğuk etanol 2.5 hacimli (245 mcL) içeren yeni bir tüp üst sulu tabaka aktarın.
      3. Çökelme -80 ° C (30 dk. O / N).
      4. 4 20 dakika santrifüj ° C
      5. 800 mcL% 70 etanol (nukleaz ücretsiz su) ile süpernatant ve yıkama pelet çıkarın. Aşırı tuz tamamen kaldırmak için pelet çıkarmak için emin olun.
      6. Başka bir 20 dakika Santrifüj 4 ° C
      7. Süpernatant ve hava kuru 15-20 dakika çıkarın.
      8. 4 mcL nükleaz ücretsiz su içinde süspanse edin pelet.

        * Örnek bir gecede inkubasyon sırasında bu sıcaklıkta donabilir. Bu aslında nükleik asitlerin verimi artırmak için gösterilmiştir.
  4. Tur 2 İlk iplikçik cDNA sentezi
      • On Ice
      • 1 mcL Rastgele astar (0.05 mg / ml) * ekleyin
    2. Isı 70 ° C'de 10 dakika. Hemen en az 5 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin.
      • 2 mcL 5x İlk iplikçik tampon ekle
      • 1 mcL DTT (100 mM)
      • 0.5 mcL dNTP (her biri 2.5 mM)
      • 0.5 mcL RNasin (40 U / ml)
      • 1 mcL Üstsimge III (200 U / ml)
    4. Pipetleme ile iyice karıştırın ve kısaca döndürün. Oda sıcaklığında 10 dakika oturmak için izin verin. Bu adım, ters transkripsiyon reaksiyonu yapmadan önce kısa rastgele primerler uzantısı izin vermek gereklidir.
    5. 42 az 30 dakika boyunca inkübe ° C
    6. Isı 5 dakika 95 ° C, DNA / RNA hibritleri RNA denatüre. En az 5 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. -20 ° C'de saklayın veya -80 ° C ya da hemen sonraki adıma devam edin.

      * Rastgele primerler konsantrasyonu önemlidir. Konsantrasyonu çok yüksek ise, ürünün daha amplifikasyon her yuvarlak kesilmiş olacaktır.
  5. Tur 2 İkinci iplikçik cDNA sentezi
      • On Ice
      • 2 mcL T7-oligo (dT) astar (10 ng / mcL) *
    2. 70 ° C'de 5 dakika için ısı Hemen en az 5 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. Kısaca Spin.
      • 43.5 mcL nükleaz ücretsiz su
      • 15 mcL 5x İkinci iplikçik tampon
      • 1.5 mcL dNTP karışımı (her biri 2.5 mM)
      • 2 mcL DNA polimeraz I (10 U / ml)
    4. Pipetleme ile iyice karıştırın ve kısaca döndürün. 16 az 2 saat boyunca inkübe ° C.
    5. 2 mcL T4 DNA polimeraz (5 U / ml)
    6. Pipetleme ile iyice karıştırın ve kısaca döndürün. 16 ° C'de 10 dakika daha inkübe
    7. Bölüm 6.2.3 Qiagen Minelute kiti kullanılarak reaksiyon temizleyin.
    8. 6.2.4 için 6.2.8 Bölüm Speedvac veya etanol yağış ile 2-4 mcL konsantre ol.

      * T7-oligo ilk tur ikinci iplikçik cDNA sentezi ile karşılaştırıldığında farklı stok konsantrasyonu (dT) astarı dikkat edin.
  6. Tur 2 in vitro transkripsiyon
    Bölüm 6.3 olarak gerçekleştirin.
    1. Bölüm kez 6,4-6,6 istediğiniz numarayı tekrarlayın. Kısa Arna ürünleri amplifikasyon sonuçlarının sonraki her tur unutmayın. Bu nedenle amplifikasyon mermi sayısı sınırlı olmalıdır. Normalde 2-3 tur amplifikasyon mikroarray analizi gerçekleştirmek için tek bir hücre hasat malzemesi yükseltmek için yeterlidir. Mikroarray analiz durumunda, üçüncü turda IVT tepki üreticinin talimatlarına göre Illumina TotalPrep RNA Amplifikasyon Kit kullanılarak yapılır. Bu prosedür sonra mikroarray çip tespiti için kullanılan Arna biotin etiketli UTP içermektedir.
    2. Nano RNA kiti ile bir Nanodrop veya Agilent Bioanalyzer kullanarak üçüncü turda Arna konsantrasyonunu ölçün.

7. Temsilcisi Sonuçlar

Başarılı primer nöronal kültürlerin tek bir hücre hasat yetenek bağlı olarak (bkz. Şekil 1), en az 2 dakika içinde tamamlanabilir. Ancak, hasat zamanı ve deneysel manipülasyon müdahale sistemleri arasında değişecektir. (Bkz. Şekil 4A ve 4B) toplam amplifiye Arna mikrogram miktarda sonuçları tek bir hücre Arna prosedüre tabi tutulması ve bir bioanalyzer (bkz. Şekil 3) ile analiz edildiğinde karakteristik geniş bir tepe oluşturur. Hızlı tek bir hücre gen ekspresyon analizi için üç tur sağlayan, en az üç gün içinde tamamlanabilir.

Şekil 1
Şekil 1 Gösterilen başarılı bir hasat izole bir nöron bir örnektir. Biz selenispeten düşük yoğunluklu bir bölge (A) cted ve pipet istediğiniz hücreye (B) doğru ilerlemiş. Üçüncü (C) hücre sonra görüş alanı hasat olmuştu gösterir. Çevreleyen süreçleri lamel kalır unutmayın.

Şekil 2
Şekil 2 Gösterilen etkili hasat için uygun olmayan bir boyutu pipet uçları iki görüntü. Bu ipuçları eksik hasat (A) ve (B) sırasıyla ortam çevreleyen hasat yol açacaktır.

Şekil 3
Şekil 3 bioanalyzer kullanarak ardından hasat ve amplifikasyon, analiz, dağıtım ve amplifiye RNA miktarını incelemek için tavsiye edilir . Tek hücre malzeme başarılı bir amplifikasyon düşük mikrogram toplam miktarda verim ve düz ve geniş bir dağılıma sahip olacaktır.

Şekil 4
Şekil 4, ilk turda (A) ve (B) Arna prosedürün ikinci turda Şemalar gösterilmiştir .

Discussion

Notlar ve Sorun Giderme

  • Öncesi ve sonrası hedef hücreyi izole olduğunu gösteren görüntüler ve kalan penumbra bakir kaldı almak isteyebilirsiniz.
  • Hasat gibi çok fazla çözüm pipet giriyor, 3 Luer-Lock parçaları yolu ve pozitif basınçlı tüp tutmak için şırınga pistonu kullanabilirsiniz. İstenilen ses işleme türüne göre değişir ama çoğu uygulama için en fazla 5 ul iyi olmalıdır.

Moleküler biyoloji teknikleri hakkında genel ipuçları

  • Vortex tüm hisse senedi tüpleri ve bir tepki eklemeden önce onları aşağı döndürün. ASLA vorteks enzimler.
  • Reaksiyonları, tampon uygun konsantrasyonda olmasını sağlamak için enzim eklemeden önce iyice karıştırın.
  • Mümkünse stratacooler kullanarak -20 ° C'de enzim stokları tutun. Aksi halde, kullanımdan önce doğru kaldırmak buz üzerinde tutmak ve -20 ° C'ye kadar hemen dönmek
  • Her zaman pipetleme hataları azaltmak için birden fazla reaksiyon hazırlarken ana karışımları olun. Örneklerin sayısına göre gerekli hacmi hesaplayın ve% 10-20 ekleyin.
  • Mağaza RNA -80 ° C geciktirir bozulması. RNA asidik koşullarda oluşur RNA geciktirir apurination tampon depolanan en istikrarlı.

Arna Usul Genel Anahat

Şekil 4A Arna prosedürün ilk turda göstermektedir. T7-oligo (dT) astar poli-T kısmı, ilk iplikli tepki olarak, Polya kuyrukları bağlanarak mRNA türleri (uzun beyaz dikdörtgen) seçer. Ayrıca bazı microRNA polyadenylated ve bu yordamı Çekilecek. Ancak, daha da önemlisi, hücre içinde en bol RNA, ribozomal RNA'lar, olmaz. Bu oligo mRNA bir şablon olarak kullanarak tamamlayıcı iplikçik cDNA (uzun gri dikdörtgen) sentezlemek için Reverse Transcriptase için bir astar olarak davranır. T7, T7-oligo (dT) astar bölümü başlangıç ​​mRNA dizisi antisens çerçeve T7 RNA polimeraz organizatörü içermektedir. Bu, daha sonra in vitro transkripsiyon tepki olarak kullanılır.

Daha sonra, önceki adımda oluşturulan mRNA / DNA hibrid mRNA gecikmeli iplikçik DNA sentezi oluşturulan Okazaki parçaları benzer RNA "primerler" (küçük beyaz dikdörtgenler) oluşturmak Rnase H tarafından kısmen hidrolize olur. DNA Polimeraz I, RNA parçaları, bir şablon olarak mRNA tamamlayıcı DNA kullanılarak asal DNA sentezi için kullanır. '3' sonraki RNA parçası, 5 ulaştığında nükleaz faaliyet ribonucleotides kaldırır ve deoxyribonucleotides ile değiştirir. DNA ligaz önde gelen iplikçik yedek tam olmayan herhangi bir ipliklerini Arter eklenir. T4 DNA Polimeraz RNA parçaları, DNA Polimeraz I oluşturarak ilk primerler olarak nerede görev alanları doldurmak için eklenen bir künt uçlu, çift tıklatın IVT reaksiyon gerçekleştirmeden önce arıtılarak cDNA mahsur.

IVT tepki olarak, T7 RNA polimeraz anlamda iplikli bir şablon olarak kullanarak çift cDNA telli ve sentezler antisens RNA molekülleri (uzun siyah dikdörtgenler) dahil T7 organizatörü bağlanır. Bu binlerce antisens RNA molekülleri her çift zincirli cDNA molekülü (Şekil 4A) üretildiği amplifikasyon adım olarak hizmet vermektedir.

Şekil 4B tasvir gibi ikinci turda, başlangıç ​​RNA bu yana ilk turda biraz daha farklı bir ters transkripsiyon reaksiyonu ile başlar antisens (düz siyah dikdörtgen) ve T7-oligo tarafından hedef alındı ​​polyadenylated kuyruk yoksun (dT) ilk turda astar. Bu nedenle, bu reaksiyon rastgele primerler (küçük gri dikdörtgenler) ve daha sonra denatüre RNA ile astarlanmalıdır. Ikinci iplikçik reaksiyon sonra önceki ters transkripsiyon tepki olarak oluşturulan anlamda RNA'nın 3 'ucuna poli-dizisi bağlanır T7-oligo (dT) astar ile astarlanmalıdır. Başka bir IVT reaksiyon ilk turda olduğu gibi aynı şekilde yapılır. Bu ikinci turda genellikle, tek bir hücre üç tur amplifikasyon elde etmek için en az bir kez tekrarlanır.

Uygulamalar

Biz bu yazıda olduğu teknikleri, uygulamalar çok sayıda tercüme edilebilir. Tek hücre izolasyonu protokol akut dilimler halinde kullanılmak üzere modifiye edilebilir. 14 teknik olarak daha zor olsa da bu alternatif hazırlanması, aynı ilkeler geçerlidir. Ayrıca, pipet boyutu biraz ayarlanır ise hücrelerin fizyolojisi kayıtları hasat fizyolojik çıkışları arkasında moleküler mekanizmaları iyi kontrollü bir soruşturma için izin vermeden önce yapılmış olabilir. Başka bir hafif bir değişiklik hücre soma süreçleri izole etmektir. Bu uygulama için 15, bir pipet ile hücre gövdeleri toplamak ve daha sonra yeni bir pipet yardımıyla geri dönün ve 100-300 tespit dendrit toplamakes veya toplama tüpünün başına aksonlar 16

Bir kez hücreler, aynı hücre popülasyonlarının içinde bile farklı ve karşılaştırmalar mRNA bollukları ve kompozisyonlar arasında yapılabilir, hasat edilmiştir. Üçüncü turda Arna içine biotinlenmiş-UTP birleştirilerek bu göreceli mRNA bollukları belirlemek için mikroarray analizi sağlar. Orijinal mRNA nüfusun kompozisyonu da yeni nesil sıralama kullanarak Arna işlemden sonra tespit edilebilir. Güçlendirilmiş Arna da, bir hücre tipi mRNA'ların tam bir set, ikinci hücre tipi fenotipi eski haline geçiş ikna etmek için farklı bir hücre tipi transfekte olduğu hücre fenotipi dönüşüm çalışmaları onaylamak için kullanılabilir bir prosedür laboratuvarı tarafından geliştirilen ve TIPeR olarak bilinen 17 Bu çalışmalar, hastalık durumları ve hücre fenotipleri ve bu tür çalışmaların eğitim için yararlıdır laboratuvarda halen devam etmektedir . RT-PCR veya qPCR hücre spesifik genlerin ifadesi onaylamak için güçlendirilmiş malzeme üzerine yapılabilir. Ayrıca, transfeksiyon veya transdüksiyon verimliliği tek hücre düzeyinde değerlendirmeler yapılabilir.

Avantajları ve Sınırlamalar

Soyut olarak belirtildiği gibi, analiz için tek hücre izolasyonu, heterojen hücre popülasyonlarının analizi ile görülen ortalama etkileri ortadan kaldırır. Bu ortalama etkileri tek bir hücre içinde bol transkript temsil eden ve ortalamayla çok düşük bolluğu transkript tespiti ve önlenmesi ile mRNA bollukları yanlış. Flow sitometri hücreleri tek tek sıralamak için kullanılan, ancak bu yöntem hücre spesifik belirteçler ve pahalı ekipman bilgisi gerektirir. 18 Lazer yakalama mikrodiseksiyon UV veya IR lazer yakalama mikrodiseksiyon sistemleri ile ya da hatta tek bir hücre ve hücre içi çekim için izin ancak ilgi hücreleri gerektirir çok ince kesitler yüzeyinde bulunan 19 flow sitometri benzer, lazer yakalama mikrodiseksiyon da pahalı ekipman gerektirir.

Yukarıda açıklanan elektrot tabanlı toplama tekniğinin en önemli avantajlarından biri, değerli elektrofizyolojik veriler aynı hücre üzerinde yapılacak işlevsel ve transcriptome analiz için izin, hasattan önce ilgi hücre elde edilebilir 20 A tekniğin dezavantajı. mikromanipülatörler kullanarak gerektirir. Mikromanipülatörler ile tanıdık Araştırmacılar, bu tekniğin çok sezgisel bulacaksınız; Ancak, böyle bir deneyime sahip bireyler gerekli ince hareketleri ile rahat olmak gerekir.

Herhangi bir büyütme tekniği doğasında boyutu ve nükleotid kompozisyon dayalı belirli transkript tercihli büyütme. 4,6,7 Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ve cDNA hızlı amplifikasyon temelli teknikler transkript üstel amplifikasyon uçları (YARIŞ) Sonuç olarak, lineer amplifikasyon ise Arna amplifikasyon işlemi sonuçları. Böylece, Arna prosedürünün en önemli avantajlarından biri mRNA transkript bağıl bollukları sadece doğrusal katlanarak yükseltme karşı kuvvetlenme sürecinde meydana gelen herhangi bir hata ya da önyargıları büyüterek daha iyi korumak için onun yeteneği yatıyor hataları ve önyargıları söyledi.

Mikroarray analizi ile birleştiğinde Arna prosedürü benzer ya da farklı morfoloji, tedavi edilen veya tedavi edilmemiş tek hücreleri arasındaki mRNA bollukları karşılaştırma için izin verir. Ayrıca, yeni nesil sıralama için amplifiye malzeme teslim edilebilir. 5,8, prosedür için rastgele primerler kullanımı aksine, oligo-dT astarlanmalıdır prosedür önyargıları amplifikasyon yukarıda açıklanan beri Ancak, bu tür analizlerde dikkat edilmelidir 3 'mRNA ve genellikle her turda daha sonra güçlendirilmiş malzemeden hafif kısalma sona erer. Bakım mikroarray sonuçları analiz bazı yanlış yok çağrılar biraz kısaltılmış güçlendirilmiş malzemeden ortaya çıkabilir gibi standart yöntemleri ile alınmalıdır. Buna ek olarak, sıralama ise sonuç gerçekten de tam 5 sağlayacaktır 'en orijinal mRNA sıra, bazı mRNA 5' dizileri kaçırmış olabilir. Bu nedenlerden dolayı, ilâvelerle, mermi sayısı sınırlı olmalı.

Disclosures

Dr Eberwine Arna patent Dr Eberwine bir pay sahibi olduğu LBS teknolojileri lisanslı bir mucit.

Acknowledgments

Dr. Terri Schochet bu belgede yer alan resimler için hücre kültürlerinin sağlamak için, hücre kültürleri korumak için kaplama ve Kevin Miyashiro için teşekkür ederiz. Buna ek olarak, Kevin Miyashiro, Dr. Peter Buckley ve Tiina Pertiz Arna prosedürü giriş için teşekkür ederiz. Bu çalışma için fon Ulusal Yaşlanma Enstitüsü, Ulusal Ruh Sağlığı ve Pennsylvania Topluluğu İnsan Kaynakları Gerçek Bulucu fonları Enstitüsü oldu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spiegelgas coverslips Carolina Biological 63-3029
Nunc 35x10 mm culture dishes Fisher Scientific 12-565-90
Water for cell culture Lonza Inc. 17-724Q For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips
Poly-D-Lysine MW70-150K Sigma-Aldrich 6407
Laminin, ultrapure BD Biosciences 354239
Boric acid Sigma-Aldrich B0252
MEM with Earle’s salts and glutamax Invitrogen 41090-101 For plating cells
D-glucose Sigma-Aldrich G8769
Penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122
Horse serum Invitrogen 16050
Cytosine beta-D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich C1768
MEM with Earle’s salts and L-glutamine Invitrogen 11095-098 For growing cells
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
B27 serum-free supplement Invitrogen 17504-044
Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length) Kimble Chase 34500 99 Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained.
HBSS Invitrogen 14175 Any solution will work as long as the components won’t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+)
1ml syringe BD Biosciences 309628
Needle BD Biosciences Gauge depends on the diameter of the pipettes
dNTP mix Amersham 28-4065-51
dt-T7 oligo Custom Midland Certified
Second strand buffer (5x) Invitrogen Y01129
DTT Supplied with second strand buffer
E.coli DNA Ligase Invitrogen 100002324
DNA polymerase I Invitrogen 100004926
Rnase H Invitrogen 18021-071
Megascript T7 kit Ambion AM1334
Random primers BMB 11034731001
Superscript III Reverse Transcriptase Invitrogen 56575 in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT
MEGAclear Kit Ambion 1908
MinElute Reaction Cleanup Kit Qiagen 28206
T4 DNA polymerase Invitrogen 100004994
Rnasin Promega Corp. N251B
Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit Ambion AMIL1791
Flaming/Brown micropipette puller Sutter Instrument Co. P-87 Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook
Micromanipulator Olympus Corporation Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models
Pipette Holder Warner Instruments MP-S15A Will vary with micromanipulator and pipette O.D.
Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit Agilent Technologies 5067-1511

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Davis, J. E., Eberwine, J. H., Hinkle, D. A., Marciano, P. G., Meaney, D. F., McIntonsh, T. K. Methodological considerations regarding single-cell gene expression profiling for brain injury. Neurochemical Research. 29, 1113-1121 (2004).
  2. Eberwine, J. Single-cell molecular biology. Nature Neuroscience. 4, 1155-1156 (2001).
  3. Kamme, F., Salunga, R., Yu, J., Tran, D., Zhu, J., Luo, J., Bittner, A., Guo, H., Miller, N., Wan, J., Erlander, M. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: Demonstration and Validation of Cellular Heterogeneity. The Journal of Neuroscience. 23, 3607-3607 (2003).
  4. Hinkle, D., Glanzer, J., Sarabi, A., Pajunen, T., Zielinski, J., Belt, B., Miyashiro, K., McIntosh, T., Eberwine, J. Single neurons as experimental systems in molecular biology. Progress in Neurobiology. 72, 129-142 (2004).
  5. Ginsberg, S. D., Elarova, I., Ruben, M., Tan, F., Counts, S. E., Eberwine, J. H., Trojanowski, J. Q., Hemby, S. E., Mufson, E. J., Che, S. Single-cell gene expression analysis: Implications for Neurodegenerative and Neuropsychiatric Disorders. Neeurochemical Research. 29, 1053-1064 (2004).
  6. Eberwine, J., Spencer, K., Miyashirto, K., Mackler, S., Finnell, R. Complementary DNA synthesis in situ: methods and applications. Methods Enxymol. 216, 80-100 (1992).
  7. Eberwine, J., Yeh, H., Miyashiro, K., Cao, Y., Nair, S., Finnell, R., Zettel, M., Coleman, P. Analysis of gene expression in single live neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 3010-3014 (1992).
  8. Kelz, M. B., Dent, G. W., Therianos, S., Marciano, P. G., McIntosh, T. K., Coleman, P. D., Eberwine, J. H. Single-cell antisense RNA amplification and microarray analysis as a tool for studying neurological degeneration and restoration. Sci. Aging Knowledge Eviron. 1, re1-re1 (2002).
  9. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Research. 126, 397-425 (1977).
  10. P-1000 & P-97 Pipette Cookbook. , rev. F, Sutter Instrument. (2010).
  11. MinElute Handbook For MinElute Reaction Cleanup Kit. , Qiagen. 28-29 (2004).
  12. Megascript kit. , Ambion. 7-8 Forthcoming.
  13. MEGAclear kit. , Applied Biosystems. 4-5 Forthcoming.
  14. Eberwine, J., Kacharmina, J. E., Andrews, C., Miyashiro, K., McIntosh, T., Becker, K., Barrett, T., Hinkle, D., Dent, G., Marciano, P. mRNA expression analysis of tissue sections and single cells. The Journal of Neuroscience. 21, 8310-8314 (2001).
  15. Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 1663-1667 (1990).
  16. Miyashiro, K., Dichter, M., Eberwine, J. On the nature and differential distribution of mRNAs in hippocampal neuritis: Implications for neuronal functioning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 10800-10804 (1994).
  17. Sul, J., Wo, C. K., Zeng, F., Jochems, J., Lee, M. T., Kim, T. K., Peritz, T., Buckley, P., Cappelleri, D. J., Maronski, M., Kim, M., Kumar, V., Meaney, D., Kim, J., Eberwine, J. Transcriptional transfer produces a predictable cellular phenotype. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 7624-7629 (2009).
  18. Sow, F. B., Gallup, J. M., Sacco, R. E., Ackerman, M. R. Laser capture microdissection revisited as a tool for transcriptomic analysis: Application of an excel-based qPCR preparation software (PREXCEL-Q). Int. J. Biomed. Sci. 5, (2010).
  19. Vandewoestyne, M., Deforce, D. Laser capture microdissection in forensic research: a review. Int J Legal Med. 124, (2010).
  20. Eberwine, J., Bartfai, T. Single cell transcriptomics of hypothalamic warm sensitive neurons that control core body temperature and fever response Signaling asymmetry and an extension of chemical neuroanatomy. Pharmacol. Ther. , (2010).

Tags

Nörobilim Sayı 50 tek hücreli transcriptome Arna amplifikasyon RT-PCR moleküler biyoloji gen ekspresyonu

Erratum

Formal Correction: Erratum: Transcriptome Analysis of Single Cells
Posted by JoVE Editors on 11/18/2011. Citeable Link.

A correction was made to Transcriptome Analysis of Single Cells. There were errors in the volumes used in the aRNA Amplification section. The volumes were changed from:

  • 6.2.1 7.5 μL 5x Second strand buffer
  • 6.2.4 Add 29 μL DEPC water
    2 μL glycogen (5 mg/mL) 1/10 volume (3 μL) 3M Sodium acetate
    2.5 volumes (~250 μL) cold 100% ethanol
  • 6.2.7 Remove the supernatant and air dry for 15-20 minutes.
  • 6.3.4.2 Add 50 μL DEPC water
    2 μL glycogen (20 mg/mL)
    0.6 volumes (37.2 μL) 5M Ammonium acetate
    2.5 volumes (~180 μL) cold ethanol
  • 6.3.4.7 Remove supernatant and airy dry 15-20 minutes.
  • 6.3.5.1 Add 50 μL DEPC water
    2 μL glycogen (20 mg/mL)
    0.6 volumes (37.2 μL) 5M Ammonium acetate
    1 volume (98 μL) phenol:chlorofom:isoamyl alcohol 25:24:1 (equilibrated to pH 7.8-8.0)
  • 6.3.5.7 Remove supernatant and air dry 15-20 minutes.

to

  • 6.2.1 5.6 μL 5x Second strand buffer
  • 6.2.4 Add 40 μL DEPC water
    1 μL glycogen (5 mg/mL) 1/10 volume (5 μL) 3M Sodium acetate
    2.5 volumes (~125 μL) cold 100% ethanol
  • 6.2.7 Remove the supernatant and air dry for 15-20 minutes.
  • 6.3.4.2 Add 50 μL DEPC water
    2 μL glycogen (5 mg/mL)
    0.1 volumes (10 μL) 5M Ammonium acetate
    2.5 volumes (~275 μL) cold ethanol
  • 6.3.4.7 Remove supernatant and air dry 15-20 minutes.
  • 6.3.5.1 Add 90 μL DEPC water
    2 μL glycogen (5 mg/mL)
    0.1 volumes (10 μL) 5M Ammonium acetate
    1 volume (100 μL) phenol:chlorofom:isoamyl alcohol 25:24:1 (equilibrated to pH 7.8-8.0)
  • 6.3.5.7 Remove supernatant and air dry 15-20 minutes.
Tek Hücre Transcriptome Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morris, J., Singh, J. M., Eberwine,… More

Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome Analysis of Single Cells. J. Vis. Exp. (50), e2634, doi:10.3791/2634 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter