本文详细介绍了利用显微注射技术在极化上皮细胞中过表达和分析小GTP酶的相关操作步骤。
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方法文章
通过质粒显微注射分析极化上皮细胞中小GTP酶的功能
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
上皮细胞将其质膜极化为生化和功能上截然不同的顶膜和基底外侧膜区域，其中顶膜面向“游离”表面，而基底外侧膜则与基质及邻近细胞接触。这两个膜区域由紧密连接分隔，形成扩散屏障。当上皮细胞（如Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞）以高密度接种于聚碳酸酯滤膜上并培养数天时，可在体外成功重现顶-基底外侧极性1 2。细胞极性的建立与维持受Ras超家族的小GTP酶调控，其中包括RalA、Cdc42、Rab8、Rab10和Rab133 4 5 6 7。与所有GTP酶一样，这些蛋白在无活性的GDP结合态与有活性的GTP结合态之间循环。核苷酸结合区的特定突变会干扰这一循环过程8。例如，Rab13T22N永久性地锁定在GDP形式，因此被称为“显性负性”突变体；而Rab13Q67L则无法水解GTP，因而被锁定在“显性活性”状态7。为了分析这些蛋白在细胞中的功能，通常需高水平表达GTP酶的显性负性或显性活性等位基因，以干扰内源性蛋白的功能9。一种在短时间内实现高水平过表达的巧妙方法是，利用显微注射技术将编码目标蛋白的质粒直接导入生长在滤膜支撑物上的极化细胞的细胞核中。该方法常与共注射报告性质粒联合使用，后者编码特异性分选至顶膜或基底外侧膜的质膜受体。常用于分析向基底外侧膜分选的运输货物是一种水疱性口炎病毒糖蛋白（VSVGts045）的温度敏感型等位基因10。该蛋白在39°C下无法正确折叠，因而滞留在内质网（ER）中，而此时感兴趣的调控蛋白正在细胞质中组装。将温度转移至31°C后，VSVGts045可正确折叠，离开内质网并转运至质膜11。这一追踪过程通常在环己酰亚胺存在下进行，以抑制新蛋白的合成，从而获得更清晰的结果。本文详细描述了将质粒显微注射入极化细胞以及后续包括温度转换在内的孵育步骤，以便全面分析参与基底外侧膜分选的调控蛋白。
方案
1. 质粒DNA的提取
- 使用 Sigma-Aldrich 内毒素去除型大提试剂盒，按照制造商提供的方案制备无内毒素的 DNA。该试剂盒效果可靠，能够有效去除 DNA 制备物中的任何内毒素。若将含有内毒素的 DNA 注入细胞核，会导致细胞死亡。
- 向分离得到的 DNA 中加入 100 μl 苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），涡旋混匀后，在 Eppendorf 微型离心机中以 13,000 rpm 离心 1 分钟。将上层水相转移至新离心管中，再加入 100 μl 氯仿/异戊醇（24:1），同样进行涡旋和离心操作。将含有 DNA 的上层水相转移至另一新管中。此步骤可去除 DNA 中残留的蛋白质，防止微注射针头堵塞。
- 通过加入乙酸钠（pH 6.0）至终浓度 300 mM 以及 2 倍体积的 100% 乙醇来沉淀 DNA。于 -20°C 孵育过夜。在 Eppendorf 微型离心机中以 13,000 rpm 离心 20 分钟，收集 DNA 沉淀，用 70% 乙醇洗涤一次，最后重悬于 300 μl 无内毒素水（Sigma-Aldrich）中。
- 测定 DNA 浓度。典型的 DNA 浓度范围为 1 至 5 μg/μl。
2. MDCK 细胞的培养
- 传代MDCK细胞。计数细胞后，将4 × 105个细胞接种至透明的12 mm Transwell小室（孔....
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讨论
成功进行显微注射实验最关键的步骤是DNA的质量与纯度以及细胞的极性。若细胞缺乏极性，注射对照组中的VSVG蛋白将已经发生错误定位，导致实验无法使用。如果DNA质量较差，则可能堵塞注射针头，从而导致目标蛋白表达水平低下甚至完全不表达。此外，建议使用已知可实现高水平表达的表达质粒，例如pRKV。
如果需要检测其他货物蛋白的分选情况，可以对温度转换方案进行调整。例如，为了表达低密度脂蛋白受体，我们首先在37°C下进行显微注射，随后在37°C下孵育1小时，接着在20°C下孵育4小时（以将货物蛋白滞留在反式高尔基网络，TGN），最后在37°C下孵育2小时，并加入0.1 mg/ml环己酰亚胺以追踪蛋白向细胞表面的转运。对于某些蛋白（如Fc受体），根据目标货物蛋白合成及经由分泌途径转运的速度，20°C下的孵育时间可缩短至2小时。有关我们针对不同货物蛋白所采用的孵育条件的详细描述，请参见Nokeset al., 2008 7。
最后，该方案不仅可以用于小GTP酶的分析，理论上还可用于所有您怀疑在（极性）.......
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致谢
本研究由美国国立卫生研究院（GM070736）向 H. Fölsch 提供的资助项目支持。S.F. Ang 获得新加坡科技研究局（A*STAR）研究生奖学金资助，R.S. Kang 由疾病细胞与分子基础培训项目（GM8061）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 带加热载物台的Axiovert 200显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | 定制订单 | |
| Injectman NI2 Femtojet显微操作仪 | Eppendorf | 定制订单 | |
| Femtotips II（显微注射针） | Eppendorf | 930000043 | |
| Microloader吸头 | Eppendorf | 930001007 | |
| 透明12 mm transwell滤膜支架 | Corning | 3460 | |
| 无内毒素质粒大提试剂盒 | Sigma-Aldrich | NA0400 |
参考文献
- Mellman, I., Nelson, W. J. Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).
- Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).
- Ang, A. L., Fölsch, H., Koivisto, U. M. The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).
- Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).
- Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).
- Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).....
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