ampliPHOX tecnologia di rilevamento colorimetrico viene presentato come un'alternativa economica a fluorescenza per microarray. Sulla base di fotopolimerizzazione, ampliPHOX produce spot polimero solido visibile ad occhio nudo in pochi minuti. I risultati sono poi ripreso e interpretato automaticamente con un pacchetto software semplice ma potente.
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Articolo metodologico
ampliPHOX rilevazione colorimetrica su un DNA microarray per l'influenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
DNA microarray sono emerse come un potente strumento per la rilevazione di agenti patogeni. 1-5 Per esempio, molti esempi della capacità di tipo e sottotipo di virus influenzale sono stati dimostrati. 6-11 L'identificazione e la tipizzazione di influenza sul DNA microarray ha applicazioni sia in pubblico salute e la clinica per la diagnosi precoce, l'intervento rapido, e riducendo al minimo l'impatto di una pandemia influenzale. Fluorescenza tradizionale è attualmente il più utilizzato metodo di rilevamento microarray. Tuttavia, come la tecnologia dei microarray progredisce verso l'uso clinico, 1 sostituzione di strumentazione costosa tecnologia di rilevamento a basso costo che presentano caratteristiche di prestazioni simili a fluorescenza renderà saggi microarray più attraente e conveniente.
La rilevazione ampliPHOX colorimetrico di tecnologia destinata ad applicazioni di ricerca, ed ha un limite di rilevazione all'interno di un ordine di grandezza dei tradizionali fluorescenza 11, con un vantaggio principale è un approssimativo costo dieci volte inferiore rispetto a strumento del microarray scanner confocale necessari per fluorescenza microarray rilevamento. Un altro vantaggio è la compattezza dello strumento che consente la portabilità e flessibilità, a differenza dei tradizionali strumenti di fluorescenza. Perché la tecnologia di polimerizzazione non è così intrinsecamente lineare come rivelazione a fluorescenza, tuttavia, è più adatto per le applicazioni di densità più bassa microarray, in cui è desiderato un sì / no risposta per la presenza di una certa sequenza, come per gli array di rilevazione degli agenti patogeni. Attualmente la densità del punto massimo compatibile con la rilevazione ampliPHOX è ~ 1800 punti / array. A causa delle limitazioni densità posto, microarrays ad alta densità non sono adatti per il rilevamento ampliPHOX.
Qui, vi presentiamo la tecnologia di rilevamento colorimetrico ampliPHOX come metodo di amplificazione del segnale su un microarray a bassa densità sviluppato per la rilevazione e la caratterizzazione dei virus influenzali (FluChip). Anche se questo protocollo utilizza il FluChip (un DNA microarray) come una specifica applicazione di ampliPHOX rilevazione, ogni microarray incorporando obiettivo biotinilato possono essere etichettati e rilevati in modo analogo. Il design microarray e biotinilazione del bersaglio da catturare sono sotto la responsabilità dell'utente. Una volta che il bersaglio biotinilato è stato catturato sulla matrice, il rilevamento ampliPHOX può essere eseguito da tagging primo array con un coniugato streptavidina-label (ampliTAG). Su esposizione alla luce di usare lo strumento ampliPHOX Reader, polimerizzazione di una soluzione di monomero (ampliPHY) si verifica solo nelle regioni contenenti ampliTAG marcato obiettivi. Il polimero formato può essere successivamente colorato con un non-tossico soluzione per migliorare il contrasto visivo, seguita da immagini e analisi utilizzando un semplice pacchetto di software (ampliVIEW). Il test FluChip intero da un-estratto campione risultato può essere eseguita in circa 6 ore, e le fasi di rilevamento ampliPHOX descritto sopra può essere completata in circa 30 min.
Protocollo
1. Esempio di amplificazione con RT-PCR
- Estrarre l'RNA virale da materiale clinico o da un isolato virale del virus usando il kit Qiagen MinElute Spin in collaborazione con il QIAcube piattaforma automatizzata estrazione degli acidi nucleici. Estrazioni vengono effettuate su 200 campioni microlitri con un volume di eluizione finale di 60 microlitri. Estratti di conservare a -70 ° C o inferiore per un uso successivo.
- In un modello free-zona, preparare la RT-PCR master mix su ghiaccio secondo il protocollo del produttore. Per incorporare biotina Durante la RT-PCR, utilizzare una miscela biotinilati dNTP al posto del produttore fornito mix di dNTP. ....
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Discussione
La rilevazione ampliPHOX colorimetrico tecnologia qui presentata è una rapida, alternativa economica alla rilevazione unico colore a fluorescenza per applicazioni a bassa densità microarray. Mostrato schematicamente nella Figura 1, il principio di rilevazione si basa sull'utilizzo di una etichetta fotoiniziatore (1B). In presenza di un monomero contenente soluzione (1C), l'esposizione alla luce fa sì che il fotoiniziatore (ampliTAG) per innescare una reazione di polimerizzazione solo nelle regio.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori sono dipendenti di InDevR, Inc., una scopo di lucro. InDevR sta commercializzando la tecnologia ampliPHOX qui descritti.
Ringraziamenti
InDevR riconosce NIH / NIAID U01AI070276 e R43AI077112 per il finanziamento di tale opera.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagente / attrezzature | Fabbricante | Catalogo | Commenti |
| Qiagen MinElute Virus Kit Spin | Qiagen | 57704 | singola 60 microlitri di eluizione |
| QIAcube | Qiagen | 9001292 | opzionale |
| ABI 9800 Veloce termociclatore | Applied Biosystems | 4441166 | |
| Qiagen OneStep RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | Kit dNTP non utilizzato |
| 2x Buffer Spotting | InDevR Inc. | MI-5007 | |
| Biotinilato dNTP Mix | InDevR Inc. | MI-5009 | |
| Lambda esonucleasi | Epicentre Biotecnologie | LE032K | 2500 U, 10U/μl |
| FluChip fondo mix | InDevR | N / A | non sono ancora disponibili per la vendita |
| Shaker orbitale | Madell Tecnologia | ZD-9556-A | |
| Lavare Bins | InDevR Inc. | MI-4002 | |
| Lavare Rack | InDevR Inc. | MI-4003 | |
| Ibridazione buffer 2x | InDevR Inc. | MI-5004 | |
| Calibrazione Chips | InDevR Inc. | AP-5006 | |
| Lavare Buffer dC | InDevR Inc. | MI-5005 | |
| ampliRED | InDevR Inc. | AP-5004 | |
| ampliTAG | InDevR Inc. | AP-5001 | |
| 2x ampliTAG Buffer | InDevR Inc. | AP-5002 | |
| ampliPHY, ampliPHY enhancer | InDevR Inc. | AP-5003 |
Riferimenti
- Kumar, R. M. The Widely Used Diagnostics "DNA-Microarray"-A Review. Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).
- Miller, M. B., Tang, Y. W. Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology. Clin Microbiol Rev. 22, 611-....
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Ristampe e permessi
