يوضح هذا البروتوكول كيفية وسم الخلايا العقدية الشبكية تراجعياً، وكيفية إحداث إصابة عن طريق سحق العصب البصري لاحقاً من أجل تحليل بقاء الخلايا العقدية الشبكية وموتها المبرمج. وهو نموذج مرضي تجريبي لأنواع مختلفة من اعتلال العصب البصري، بما في ذلك الجلوكوما.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
وسحق العصب البصري النموذجي إصابة الفئران لدراسة الخلايا الشبكية بقاء العقدة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن أن تؤدي إصابة العصب البصري إلى تنكس محوري، يليه موت تدريجي لخلايا العقد الشبكية (RGCs)، مما يؤدي إلى فقدان غير قابل للاسترجاع في الرؤية. ومن الأمثلة على مثل هذه الأمراض لدى البشر الاعتلال العصبي البصري الرضحي وتنكس العصب البصري في المياه الزرقاء (الجلوكوما). ويتميز هذا المرض بتغيرات نمطية في رأس العصب البصري، وتنكس تدريجي في العصب البصري، وفقدان لخلايا العقد الشبكية، وهو ما يؤدي في حال عدم السيطرة عليه إلى فقدان الرؤية والعمى.
يُعد نموذج إصابة سحق العصب البصري (ONC) في الفئران نموذجاً مرضياً تجريبياً هاماً لاعتلال العصب البصري الرضحي والجلوكوما (المياه الزرقاء) وغيرها. في هذا النموذج، تؤدي إصابة السحق في العصب البصري إلى موت مبرمج تدريجي لخلايا العقد الشبكية. ويمكن استخدام هذا النموذج المرضي لدراسة العمليات والآليات العامة لموت الخلايا العصبية وبقائها، وهو أمر أساسي لتطوير التدابير العلاجية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام النهج الدوائية والجزيئية في هذا النموذج لتحديد واختبار العوامل العلاجية المحتملة لعلاج الأنواع المختلفة من اعتلال العصب البصري.
نقدم هنا عرضاً توضيحياً خطوة بخطوة لـ (I) الوسم الارتجاعي المرجعي للخلايا العقدية الشبكية (RGCs) في اليوم الأول، (II) إصابة سحق العصب البصري في اليوم الرابع، (III) استخلاص الشبكية وتحليل بقاء الخلايا العقدية الشبكية في اليوم الحادي عشر، و (IV) النتيجة الممثلة.
البروتوكول
جميع المعدات والكواشف المستخدمة معقمة. تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان (ACUC) في المعهد الوطني للعيون (NEI) ومعاهد الصحة الوطنية (NIH) (بروتوكول دراسة الحيوان NEI-570)، وأجريت وفقاً لإرشادات ولوائح معاهد الصحة الوطنية (NIH).
1. التوسيم الرجعي القاعدي للخلايا العقدية الشبكية (RGCs) في اليوم الأول
الغرض من هذا الإجراء هو وسم الخلايا العقدية الشبكية تراجعيًا عن طريق حقن صبغة تتبع عصبية في الأكيمة العلوية للفئران قبل ثلاثة أيام من إصابة سحق العصب البصري. ستمتص الخلايا العقدية الشبكية الصبغة تراجعيًا، مما يوفر علامة للخلايا العقدية الشبكية الحية (الشكل 1). ويؤدي هذا النهج إلى وسم قابل للتكرار للخلايا العقدية الشبكية القابلة للحياة مع تباين ضئيل 1-5.
- يتم تخدير الفأر تخديرًا عميقًا، ثم تُنظف منطقة الشعر الموجودة أعلى الرأس. يُوضع الفأر في جهاز تثبيت مجسم (stereotaxic apparatus) صغير. يُوضع مرهم واقٍ على كلتا العينين. يُطهر جلد الرأس ثلاث مرات باستخدام اليودوفور ومسحة كحول بتركيز 70%.
- يُجرى شق في الجلد للكشف عن الجمجمة، مع الحفاظ عليها جافة ونظيفة باستخدام بيروكسيد الهيدروجين بتركيز 3%.
- يتم تحديد وعلامة منطقة البريغما (bregma). يُحفر ثقب فوق الأكيمة العلوية (superior colliculus) على مسافة 2.9 mm خلف البريغما و0.5 mm جانبيًا من الخط المتوسط لكل نصف كرة دماغية7. وأثناء الحفر، يُوضع محلول ملحي في موقع الثقب لمنع الإصابة الحرارية الثانوية.
- باستخدام جهاز قياس مجسم وحقنة هاميلتون (Hamilton syringe)، يُحقن صبغ تتبع العصبونات FluoroGold (مقدار 1 μl من الفلوروكروم بتركيز 3% في محلول ملحي) ببطء شديد في الأكيمة العلوية لكل نصف كرة دماغية على عمق 1.6 mm من السطح العظمي للدماغ.
- يتم خياطة موقع الشق. تُعطى حقنة تحت الجلد من البوبرينورفينين (buprenorphine) كمسكن للألم.
- يُنقل الفأر إلى منطقة دافئة وجافة ويتمت مراقبته حتى يستعيد قدرته على الحفاظ على وضعية الجسم القائمة، ثم يُعاد إلى قفصه. خلال الأيام الثلاثة الأولى بعد إجراء الوسم، تُعطى مسكنات جهازية (مثل البوبرينورفينينين) ومرهم مضاد حيوي موضعي مرتين يوميًا، مع مراقبة الفأر بدقة.
2. إصابة سحق العصب البصري في اليوم الرابع
في هذا الإجراء، سنقوم بتطبيق إصابة سحق على العصب البصري لإحداث ضرر أولي في المحاور العصبية (الشكل 2)، مما سيؤدي إلى موت تدريجي لخلايا العقد الشبكية.
- بعد ثلاثة أيام من تطبيق صبغة التتبع، يتم تخدير الفأر تخديراً عميقاً. وباستخدام مجهر تشريحي، يتم عمل شق في ملتحمة إحدى العينين عند موضع الساعة 4 تقريباً باستخدام مقص زنبركي.
- يتم إزاحة العضلات الحجاجية برفق وإبعادها جانباً، ثم كشف العصب البصري الأبيض عند مخرجها من مقلة العين، مع توخي الحذر الشديد لعدم إتلاف أي من الأوعية الدموية.
- بمساعدة ملقط ذو فعل متقاطع، يتم إحداث إصابة سحقية للعصب البصري على مسافة 2 mm تقريباً من مقلة العين لمدة 3 ثوانٍ تقريباً. يجب الحرص الشديد على عدم إتلاف الشريان العيني لتجنب حدوث نزيف.
- بعد إتمام عملية السحق، يتم خياطة الشق.
- قبل أن يفيق الفأر من التخدير، يتم إعطاؤه حقنة تحت الجلد من buprenorphine لتسكين الألم.
- يُنقل الفأر إلى منطقة دافئة وجافة ويتم مراقبته حتى يصبح قادراً على الحفاظ على وضعية منتصبة، ثم يُعاد إلى قفصه. وخلال الأيام الثلاثة الأولى التي تلي إجراء إصابة السحق، تُعطى مسكنات جهازية (مثل buprenorphine) ومرهم مضاد حيوي موضعي مرتين يومياً مع مراقبة الفأر بدقة.
3. حصاد الشبكات وتحليل بقاء الخلايا العقدية الشبكية في اليوم 11
الغرض من هذا الإجراء هو استخلاص الشبكية لتحليل بقاء الخلايا العقدية الشبكية.
- في اليوم 11 (اليوم السابع بعد عملية ONC)، يتم القتل الرحيم للفأر عن طريق ضخ CO2 والخلع العنقي.
- يتم استئصال العينين باستخدام ملقط عن طريق الضغط على المحجر.
- تُثبت العينان في محلول بارافورمالدهيد بتركيز 4% لمدة ساعتين وتُغسل بمحلول PBS ثلاث مرات. يتم تشريح الشبكية. وقد سبق نشر إجراء تشريح الشبكية بواسطة JoVE في عام 2010 من قبل Gustmann, S. et al.6، ولذلك لن يتم وصفه هنا.
- تؤخذ صور لخلايا العقدة الشبكية الباقية باستخدام مجهر فلوري في مناطق محددة من الشبكية، ويمكن بعد ذلك حساب كثافة خلايا العقدة الشبكية. يوضح الشكل 3 نتيجة نموذجية لخلايا العقدة الشبكية المصبوغة بالفلور في حالة وجود أو عدم وجود إصابة ناتجة عن سحق العصب البصري.
4. النتائج التمثيلية:
لتحليل بقاء خلايا العقدة الشبكية، تم استئصال الشبקיات وتثبيتها وبسطها وتثبيتها على الشرائح بعد سبعة أيام من إصابة سحق العصب البصري. التُقطت صور للشبكية باستخدام مجهر فلوري. وبالمقارنة مع الشبكية الطبيعية غير المصابة (اليسار، Normal)، يظهر أن عدد خلايا RGCs الحية (باللون الأخضر، والموسومة تراجعياً بواسطة صبغة FluoroGold للتتبع العصبي المحقونة في الأكيمة العلوية) أقل بكثير في الشبקיات المصابة بسحق العصب البصري (اليمين، ONC) (الشكل 3).
الشكل 1. الوسم الرجعي المرجعي لخلايا العقدة الشبكية
من أجل عد خلايا العقدة الشبكية الحيوية في نقاط زمنية مختلفة بعد إصابة سحق العصب البصري، يتم وسم خلايا العقدة الشبكية رجعيًا عن طريق حقن صبغة تتبع عصبية (باللون الأخضر) في الأكيمة العلوية في الدماغ قبل ثلاثة أيام من إصابة سحق العصب البصري (باللون الأحمر). ونظرًا لأن محاور خلايا العقدة الشبكية تستقر في الأكيمة العلوية، فإن صبغة التتبع سيمتصها RGCs رجعيًا، مما يوفر علامة للخلايا RGCs الحية.
الشكل 2. إصابة سحق العصب البصري
من أجل تحليل حالة بقاء خلايا العقد الشبكية، يتم تطبيق إصابة سحق على العصب البصري (باللون الأحمر) للتسبب في ضرر أولي للمحاور العصبية، وهو ما سيؤدي إلى موت تدريجي لخلايا العقد الشبكية. بعد ثلاثة أيام من حقن صبغة التتبع (باللون الأخضر)، يتم تخدير الفأر. يتم إجراء شق في ملتحمة إحدى العينين، ثم تُزاح العضلات الحجاجية وتوضع جانبًا. يتم كشف العصب البصري عند مخرجه من مقلة العين. ثم تُطبق إصابة سحق على العصب البصري على بُعد حوالي 2 mm من مقلة العين لمدة 3 s تقريبًا باستخدام ملقط ذو حركة متقاطعة.
الشكل 3. خلايا العقدة الشبكية المصبوغة بالفلورسنت مع أو بدون إصابة سحق العصب البصري
لتحليل بقاء خلايا العقدة الشبكية، تم استئصال الشبكات وتثبيتها وبسطها وتثبيت شرائحها بعد سبعة أيام من إصابة سحق العصب البصري. تم التقاط صور الشبكية باستخدام مجهر فلوري. وبالمقارنة مع الشبكية الطبيعية غير المصابة (يسار، Normal)، كان عدد خلايا RGCs الحية (باللون الأخضر، والموسومة تراجعياً بواسطة صبغة التتبع العصبي FluoroGold المحقونة في الأكيمة العلوية) أقل بكثير في الشبكات التي تعاني من إصابة سحق العصب البصري (يمين، ONC) (الشكل 3). شريط المقياس: 50 μm
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعد نموذج إصابة سحق العصب البصري في الفئران مفيداً لدراسة عملية موت وبقاء الخلايا العقدية الشبكية (RGC). كما يُستخدم هذا النموذج غالباً لاستقصاء تأثيرات الكواشف والجينات المختلفة على موت الخلايا المبرمج وبقاء الخلايا العقدية الشبكية. وتتمثل إحدى مزايا هذا النموذج في تميزه بدرجة عالية من القابلية للتكرار مع وجود تباينات طفيفة.
ومع ذلك، يلزم توخي عناية خاصة في عدة خطوات من هذا النموذج. أولاً، عند إجراء إصابة سحق العصب البصري، من الضروري عدم استخدام قوة مفرطة وعدم السحق لفترة طويلة جداً، لأن ذلك ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
يتم دعم أبحاثنا من خلال برنامج الأبحاث الداخلية التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH)، المعهد الوطني للعيون.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| جهاز التوجيه المجسم | ASI Instruments | SAS-4100 | |
| مجهر تشريحي | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
| مقبض مشرط | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| شفرات مشرط #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| مثقاب دقيق | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| إبرة خياطة | Fine Science Tools | 12050-03 | |
| مقص زنبركي | Fine Science Tools | 16144-13 | |
| ملقط Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-50 | |
| حقنة Hamilton | Hamilton Co | 88400 | |
| إسفنج شاش | Office Depot | 674889 | |
| فلوروكرم | Sigma-Aldrich | 39286 | |
| كحول | Sigma-Aldrich | 459844 | 70% |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H3410 | 3% |
المراجع
- Yoles, E. GM1 reduces injury-induced metabolic deficits and degeneration in the rat optic nerve. Investigative ophthalmology & visual science. 33, 3586-3591 (1992).
- Fisher, J. Vaccination for neuroprotection in the mouse optic nerve: implications for optic neuropathies. J Neurosci. 21, 136-142 (2001).
- Levkovitch-Verbin, H. RGC death in mice after optic nerve crush injury: oxidative stress and neuroprotection. Investigative ophthalmology & visual science. 41, 4169-4174 (2000).
- Li, Y. VEGF-B inhibits apoptosis via VEGFR-1-mediated suppression of the expression of BH3-only protein genes in mice and rats. The Journal of clinical investigation. 118, 913-923 (2008).
- Tang, Z. Survival effect of PDGF-CC rescues neurons from apoptosis in both brain and retina by regulating GSK3beta phosphorylation. The Journal of experimental medicine. 207, 867-880 (2010).
- Gustmann, S., Dunker, N. In vivo-like organotypic murine retinal wholemount culture. J Vis Exp. , (2010).
- Franklin, K., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. San Diego. (1997).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
