濒死细胞通过邻近细胞的协同收缩从上皮组织中被挤出，而不会破坏其屏障功能。斑马鱼发育过程中具有良好的光学通透性，为在活体上皮中可视化观察细胞挤出提供了优良的实验系统。本文中，我们描述了在幼年斑马鱼表皮中诱导并以细胞分辨率成像细胞挤出的方法。
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本文内容
摘要
摘要
上皮组织的稳态维持需要持续清除受损细胞，同时不破坏其屏障功能。我们的研究发现，即将死亡的细胞会向周围的活细胞发送信号，促使它们形成并收缩一个肌动蛋白和肌球蛋白构成的环状结构，将死亡细胞从上皮层中排出，并在细胞排出后及时闭合可能形成的空隙，这一过程称为细胞挤出1。斑马鱼发育过程中的光学透明性为在活体上皮组织中观察细胞挤出提供了理想的系统。本文描述了一种在幼年斑马鱼表皮中诱导并成像细胞挤出的方法。为了可视化细胞挤出过程，我们在表皮表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼单细胞期胚胎中注射标记了红色荧光蛋白的F-肌动蛋白探针，并通过向幼鱼中添加G418诱导细胞凋亡。随后，利用转盘共聚焦显微镜进行延时成像，观察凋亡细胞挤出过程中肌动蛋白的动态变化及上皮细胞的行为。该方法使我们能够在活体上皮组织中研究细胞挤出过程，并为探索因无法有效清除凋亡细胞而导致的疾病状态提供途径。
方案
斑马鱼表皮发育过程中细胞挤压期间肌动蛋白动态变化的可视化基本操作流程
发育中的斑马鱼表皮由两个不同的层组成：表层（或称外胚层）和一层与基底膜接触的基底层细胞2。外层表层细胞经历凋亡，并通过挤压作用从组织中被清除3 （图1）。为了实时观察这一过程，我们将编码红色荧光蛋白与肌动蛋白结合蛋白utrophin的calponin同源结构域融合蛋白（RFP-UtrCH）的RNA4,5，注射到在分层上皮启动子cytokeratin 8驱动下表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因斑马鱼单细胞期胚胎中6 （图2A）。尽管注射RNA后RFP-UtrCH在整个动物体内普遍表达，我们重点关注同时表达RFP和GFP的浅层表皮细胞，以特异性追踪表皮中的肌动蛋白动态变化（图2B）。随后，我们用G418处理幼鱼以诱导凋亡细胞的挤压排出，并使用转盘共聚焦显微镜对表皮及肌动蛋白丝进行成像，获取四维数据集。
实验开始前
- 体外 使用 mMessage mMachine SP6 试剂盒（Ambion）以线性化 DNA 模板转录 RNA，并使用 RNeasy Mini 试剂盒（Qiagen）纯化加帽 RNA。用无菌水将 RNA 稀释至约 60 n....
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讨论
本文所述方案展示了一种简单直接的方法，用于在活体上皮组织中可视化细胞挤压过程。此类实验使我们能够观察到在固定组织分析中此前未被充分认识的肌动蛋白动态的细微特征，从而补充了常用的免疫荧光方法。我们可以将本方案与化学抑制剂或遗传突变体结合使用，以更深入地分析细胞挤压过程，并研究因无法清除凋亡细胞而导致的疾病状态，我们预计这将引发炎症反应或受损细胞的积累，如在癌症中所见。例如，我们实验室此前已证明，化学抑制剂可与G418联合使用，以改变肌动蛋白丝在细胞基底外侧表面的定位，从而影响细胞挤压的方向3。当前方法的一个局限性在于，由于细胞死亡具有随机性和不可预测性，我们的数据集通常集中在挤压过程的后期阶段。为了研究多细胞肌动蛋白环的形成及收缩的启动，未来的实验将采用技术手段，在一组经荧光标记且遗传靶向诱导凋亡的上皮细胞中诱导细胞凋亡10。将该策略与我们在表皮中成像肌动蛋白动态的方法相结合，应有助于研究导致凋亡细胞挤压的早期步骤。总体而言，这些实验所获得的信息将显著增进我们对上皮细胞挤压及其医学意义的理解。
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披露
动物福利保证
本方案中使用斑马鱼（Danio rerio）开展的所有操作均已获得犹他大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准（动物福利保证编号：#10-07017）。
致谢
我们感谢Rosenblatt实验室成员提供的科学讨论、建议和意见。我们还要感谢Mary Halloran慷慨提供了编码RFP-UtrCH的质粒，以及David Grunwald提供了CK:GFP转基因斑马鱼。同时感谢Gretchen King及犹他大学中央斑马鱼资源中心的工作人员对斑马鱼的优良维护与照料。本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）国家普通医学科学研究所（NIGMS）NIH主任新创新者奖1 DP2 OD002056-01资助，授予JR。GTE获得了NIH多学科癌症培训项目资助5T32 CA03247-8的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 | |
|---|---|---|---|---|
| RNeasy Mini Kit | 试剂 | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | 试剂 | Ambion | AM1340 | |
| 交配箱 | 工具 | Thoren Aquatic Systems | ||
| 移液器泵 | 工具 | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ 巴斯德移液管 | 工具 | VWR international | 14672-608 | |
| 显微注射模具 | 工具 | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm 培养皿 | 工具 | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown 微量移液管拉制仪 | 工具 | Sutter Instrument Co. | Model P97 | |
| 带纤维的硼硅酸盐玻璃毛细管 | 工具 | Sutter Instrument Co. | B1400-78-10 | 外径 1.0mm，内径 0.78mm，长度 10cm |
| 电极储存罐 | 工具 | World Precision Instruments, Inc. | E210 | |
| 酚红 | 试剂 | Sigma-Aldrich | P0290 | DPBS 中 0.5% |
| 压力控制显微注射仪和显微操作器 | 工具 | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm 培养皿 | 工具 | Cellstar | 627-160 | |
| G418（遗传霉素） | 试剂 | GIBCO, by Life Technologies | 10131-035 | dH20 中 50 mg/mL |
| Dumont #5 镊子 | 工具 | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm 针头夹持器 | 工具 | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| 插入针 | 工具 | Fine Science Tools | 26007-02 和 -03 | |
| 带 1.5 盖玻片的玻璃底培养皿 | 工具 | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | |
| 低熔点琼脂糖 | 试剂 | Fisher Scientific | BP1360-100 | |
| 三卡因 | 试剂 | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| 解剖显微镜 | 显微镜 | Leica Microsystems | MZ6 | |
| 解剖显微镜 | 显微镜 | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| 荧光解剖显微镜 | 显微镜 | Olympus Corporation | S2X12 | |
| 转盘共聚焦显微镜 | 显微镜 | Nikon Instruments | Eclipse Ti | 配备 Yokagawa 转盘头 |
| CCD 相机 | 相机 | Andor | DV-885-VP | 1002x1004 像素，8 微米方形像素 |
参考文献
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y.
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重印与许可
