Ein Verfahren zur Flüssig-Kultivierung und die Abgabe von C. elegans Stämme, fluoreszierenden Reporter-Proteinen wird beschrieben, dass keine teuren Sortieranlagen. Dieser Ansatz kann auf zahlreiche induzierbaren angewendet werden C. elegans Gene für die Wirkstoffforschung oder Biosensorik von Schadstoffen.
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Methodenartikel
High-Throughput-Screening und Biosensorik mit Fluorescent C. elegans Die Stämme
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
High-Throughput-Screening (HTS) ist ein leistungsstarkes Konzept zur Identifizierung von chemischen Modulatoren der biologischen Prozessen. Allerdings sind viele Verbindungen in Bildschirmen mit Zellkultur-Modellen identifiziert oft, dass sie giftig oder pharmakologisch inaktiv in vivo 1-2. Screening in ganz Tiermodelle können zur Vermeidung dieser Gefahren und optimieren den Weg zur Entwicklung von Medikamenten.
C. elegans ist ein vielzelligen Organismus-Modell auch für HTS geeignet. Es ist klein (<1 mm) und kann wirtschaftlich gezüchtet werden und abgefüllt in Flüssigkeiten. C. elegans ist auch einer der experimentell handhabbar Tiermodelle erlauben eine schnelle und detaillierte Identifizierung von Wirkstoffkandidaten mode-of-Aktion 3.
Wir beschreiben ein Protokoll für die Kultivierung und Abgabe fluoreszierender Stämme von C. elegans für das Hochdurchsatz-Screening von chemischen Bibliotheken oder den Nachweis von Umweltschadstoffen, dass die Expression eines bestimmten Gens zu verändern. Eine große Anzahl von entwicklungspolitisch synchronisiert Würmer sind in flüssiger Kultur angebaut, geerntet, gewaschen und aufgehängt an einer definierten Dichte. Würmer sind dann schwarz, mit flachem Boden 384-well-Platten mit einer peristaltischen Flüssigkeitsspender aufgenommen. Kleine Moleküle aus einer chemischen Bibliothek oder Proben (z. B. Wasser, Nahrung oder Boden) kann in die Vertiefungen mit Würmern hinzugefügt werden. In vivo Echtzeit-Fluoreszenz-Intensität mit einem Fluoreszenz-Mikroplatten-Reader gemessen. Diese Methode kann zu jeder induzierbaren Gens in C. angepasst werden elegans, für die eine geeignete Reporter zur Verfügung steht. Viele induzierbare Stress-und Entwicklungsbiologie transkriptionelle Wege sind gut in C definiert elegans und GFP transgenen Reporter-Stämme bereits für viele von ihnen 4 existieren. Wenn mit der entsprechenden transgenen Reporter kombiniert, können unsere Methode verwendet, um für die Bahn-Modulatoren Bildschirm oder robust Biosensor-Assays für Umweltschadstoffe zu entwickeln.
Wir zeigen unseren C. elegans Kultur und Abgabe-Protokoll mit einem HTS-Assay wir entwickelt, um die C-Monitor elegans cap 'n' Kragen Transkriptionsfaktor SKN-1. SKN-1 und seine Säuger Homolog Nrf2 aktivieren zytoprotektive Gene während der oxidative Stress und xenobiotische 5-10. Nrf2 schützt Säugetiere aus zahlreichen altersbedingten Erkrankungen wie Krebs, Neurodegeneration und chronischen Entzündungen und ist zu einem wichtigen chemotherapeutischen Ziel 11-13. Unser Test auf einem GFP transgenen Reporter für die SKN-1 Zielgen gst -4 14 basiert, die kodiert für ein Glutathion-S-Transferase 6. Die gst -4 Reporter ist auch ein Biosensor für Fremdstoff-und oxidative Chemikalien, die SKN-1 zu aktivieren und können verwendet werden, um niedrige Konzentrationen von Kontaminanten wie Acrylamid und Methyl-Quecksilber 15-16 zu erkennen.
Protokoll
1. Vorbereitung der bakteriellen Wurm Lebensmittel
Tag 1
- 5 ml gesättigte E. coli OP50 Bakterienkultur zu 500 ml Brühe Terrific mit 50 ug / ml Streptomycin ergänzt und wachsen in einem Schüttelinkubator (225 rpm) über Nacht bei 37 ° C.
Tag 2
- Split der Nacht Bakterienkultur in zehn 50 ml-und Zentrifugenröhrchen Bakterien in einer Kühlzentrifuge bei 2.500 rcf für 20 Minuten.
- Abdekantieren LB Brühe und resuspendieren jeder Bakterienpellet in 10 ml Flüssigkeit Nematoden Nährmedien (NGM). Schütteln Sie horizontal in einem Stockwerk Schüttler für 15 Minuten, um die....
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Diskussion
Wir stellen eine Methode zur Kultivierung und Abgabe einer großen Anzahl von transgenen Nematoden. Die Ausrüstung für die Kultivierung von Würmern verwendet wird Standard für Labors, die molekulare Klonierung und der Liquid-Handling-und Fluoreszenz-Ausstattung ist Standard für Labors Verarbeitung einer großen Anzahl von Mikroplatten. Andere Methoden der Abgabe eine große Anzahl von Live-C elegans teure Partikel Sortieranlagen 19. Die Pgst-4:: GFP-Assay kann zum Screening niedermolekularer Mo.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
C. elegans Transgene wurden von den Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, Minneapolis, MN) zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde vom NIH R21 gewähren NS0667678-01 bis KS unterstützt. Alle Autoren nahmen an der Erhebung, Analyse und Interpretation der Daten. CKL, KS, und KPC nahmen schriftlich und Überarbeitung des Manuskripts.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare (optional) |
| LB-Medium | Research Products International Corp | L24066 | |
| Terrific Bouillon | Research Products International Corp | T15100 | |
| Synergy ™ HT Multi-Mode Mikroplatten-Reader | BioTek | Filter: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
| Worm Verzicht Kolben | Süd Scientific Inc., Micanopy, FL | Benutzerdefinierte montiert (352) 284-2531 | |
| 384 Mikrotiterplatten | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Atmungsaktive Dichtband | Nunc | 241205 | |
| (5-Hydroxy-p-naphthoqinone) Juglone | ACROS | 121640010 | Juglon ist in DMSO gelösten |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans transgenen Stammes | Autor Labor | VP596 | Pgst-4:: GFP und PDOP-3:: RFP |
Referenzen
- Simeonov, A. Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade. PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we.....
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Nachdrucke und Genehmigungen
