이 프로토콜은 교양 세포에 준수 아르 단위를 형성하는 박테리아 식민지의 숫자를 계산에 구성된 간단한 세균 유착 분석이다. 분석은 강력한이며, adhesin 독립 공부하고, 다수의 유사 콘텐츠는 세균 pathogenesis 작업을 대부분의 실험실에 사용됩니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
감염을 원인 박테리아들은 숙주를 식민지해야합니다. 세균성 병원균은 세포 하나를 호스트하기 위해 첨부 파일을 홍보할 수 다양한 분자 또는 구조를 표현한다. 이러한 adhesins는 숙주 세포 표면 수용체 또는 박테리아와 호스트 사이의 다리 역할을 수용성 단백질과 상호 작용에 의존하고 있습니다. 접착력 전에 침략 및 / 또는 독소의 분비에 중요한 첫 번째 단계이며, 따라서 그것은 세균 pathogenesis에서 공부하는 주요 행사입니다. 또한, 준수 박테리아는 종종 정교하게 미세 조정 세포 반응, '세포 미생물학'2의 분야에 출산을 가지고있는 연구를 유도. 세균성 호스트 세포의 접착과 침략에 대한 강력한 assays 따라서 세균 pathogenesis 연구의 핵심 역할을하고 오랫동안 많은 선구자 실험실 3,4에서 사용되었습니다. 이러한 assays 이제 세균 pathogenesis 작업 대부분의 실험실에서 연습하고 있습니다.
여기, 우리는 특정 adhesin의 기여를 설명하는 표준 준수 분석을 설명합니다. 우리는 대장균 스트레인 2787 5, 확산 준수 (아이다)에 관련된 autotransporter Adhesin을 표현하는 인간 병원성 변형을 사용합니다. 컨트롤로서, 우리는 아이다 유전자, 2787Δ 아이다 (F. 버타이오메와 M. Mourez, 발표되지 않은), 그리고 E. 상업 실험실 부담을 부족한 돌연변이 변형을 사용하여 대장균, C600 (뉴 잉글랜드 Biolabs). 박테리아는 일반적으로 사용되는 C 형 간염 - 2 인간 상피 세포주에서 세포을 준수하기 위해 남아 있습니다. 이 분석은 덜 광범위 6 이전에 설명되었습니다.
프로토콜
1. 예선 : 박테리아 변종과 상피 세포.
세포 및 박테리아의 조작은 층류 후드 아래 무균 수행됩니다.
- 갓 E.을 분리 콜리 변종 2787, 2787Δ 아이다 및 C600 글리세롤 주식의 Lysogeny 스프 (LB) 한천 플레이트 (1 % tryptone, 0.5 %의 나트륨 염화물, 0.5 % 효모 추출물, 1.5 %의 한천)에 37에서 성장 ° C. 검정의 다양성을 최소화하기 위해, 그것은 갓 도금 변종을 항상을 사용하고 ° C 봉인 페트리 접시에서만 몇 주 최대 4에서 긴장을 유지 좋습니다.
- 높은 포도당 Dulbecco의 수정 이글 중간 (DMEM)에 문화 형 간염 - 2 세포 (ATCC CCL - 23) 10 % 열 inactivated 소 혈청 (열 불활 성화가 ° C 30 분 56 수행)와 보충. 일상 문화 중에 우리는 또한 10 U / ML 페니실린 및 10 μg / ML 스트렙토 마이신을 추가합니다.
- 37 형 간염 - 2 세포를 성장 ° CO 2 5 %를 포함하는 분위기 세포 배양기에서 C. 75cm 2 flasks 그들이 합류에 도달 subcultured 때마다에서 재배하는 세포를....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜은 (gentamicin 보호 분석 3을 사용 예) 침략을 공부하기 위해 수정할 수있는 표준 준수 세균 분석을 설명합니다. 콜로니 형성 단위의 계산은 Giemsa의 얼룩 같은 현미경 표준 시각화 기법에 의존 접근과 비교하여, 부량 수 있습니다. 후자는 접착력의 질적 전망을 제공하지만 접착력의 다양한 패턴을 차별하고 mechanistical 통찰력에게 9 줄 수 있기 때문에 종종 유용하게 보완합니다. 예를 들어 Giemsa이 2787의 10 7 cfu의 inoculum 수행할 얼룩은 그림 2에 표시된 및 Diffusely 준수 대장균 10 특징 전체 세포 표면에 확산 접착력을 나타냅니다.
이 프로토콜의 양적 측면에도 불구하고, 그것은 결과가 일반적으로 변수는 것을 강조해야합니다. 긍정적인 컨트롤보다 접착력의 100 배 낮은 수준 - 부정적인 컨트롤은 일반적으로 10 ~ 필요.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
저자의 연구실에서 작업은 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회, 건강 연구의 캐나다 연구소, 그리고 캐나다 연구 의자 프로그램에서 교부금에 의해 지원됩니다. JL은 퐁 드 물리 엉 쌍떼 두 퀘벡에서 지원금을 통한 Groupe D' 에투드 데스 Protéines Membranaires (GEPROM)에서 화목에 의해 지원됩니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| 높은 포도당 DMEM | GIBCO - Invitrogen | 12430-054 | |
| DDPBS | GIBCO - Invitrogen | 14190-144 | |
| 보빈 성장 세럼 | Hyclone | SH3054 | |
| 페니실린 / 스트렙토 마이신 | GIBCO - Invitrogen | 15140-148 | |
| 24 웰 플레이트 | 코닝 | 3337 | |
| 트리톤 X - 100 | 피셔 사이 언티픽 | BP151 - 100 |
참고문헌
- Kline, K. A. Bacterial adhesins in host-microbe interactions. Cell Host Microbe. 5, 580-580 (2009).
- Cossart, P., Boquet, P., Normark, S., Rappuoli, R. Cellular microbiology emerging. Science. 271, 315-315 (1996).
- Elsinghorst, E. A.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
