Une méthode cytométrie en flux pour l'identification et l'analyse moléculaire de la différenciation-spécifiques au stade progéniteurs érythroïdes murines et précurseurs, directement dans la moelle osseuse de souris fraîchement récoltés, de la rate ou du foie fœtal. Le test repose sur la surface des cellules CD71 marqueurs, Ter119, et la taille des cellules.
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Article de méthode
Identification et analyse des progéniteurs érythroïdes de la souris en utilisant les CD71/TER119 cytométrie en flux Assay
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Dans cet article
Résumé
Résumé
L'étude de l'érythropoïèse a pour objectif de comprendre comment les cellules rouges sont formés à partir de progéniteurs hématopoïétiques et érythroïdes tôt. Plus précisément, le taux de formation de globules rouges est régulée par l'hormone érythropoïétine (Epo), dont la synthèse est déclenchée par une hypoxie tissulaire. Une menace pour les résultats adéquats oxygénation tissulaire à une augmentation rapide de l'Epo, la conduite d'une augmentation du taux de l'érythropoïèse, un processus connu comme la réponse au stress érythropoïétique. L'augmentation du nombre de cellules circulantes rouges améliore l'apport d'oxygène des tissus. Une réponse au stress efficaces érythropoïétique est donc essentielle à la survie et au rétablissement de conditions physiologiques et pathologiques telles que l'altitude élevée, une anémie, des hémorragies, une chimiothérapie ou une transplantation de cellules souches.
La souris est un modèle clé pour l'étude de l'érythropoïèse et sa réponse au stress. Souris érythropoïèse définitive (de type adulte) a lieu dans le foie fœtal entre les jours embryonnaires 12,5 et 15,5, dans la rate néonatale, et dans la rate et la moelle osseuse adulte. Les méthodes classiques d'identification progéniteurs érythroïdes dans le tissu reposent sur la capacité de ces cellules pour donner naissance à des colonies de cellules rouges lorsque plaquées Epo contenant milieux semi-solides. Leur descendance précurseurs érythroïdes sont identifiés sur la base des critères morphologiques. Aucune de ces méthodes classiques permettent d'accéder à un grand nombre de cellules érythroïdes différenciation spécifiques au stade de l'étude moléculaire. Nous présentons ici une méthode cytométrie en flux d'identifier et d'étudier la différenciation spécifiques au stade progéniteurs érythroïdes et des précurseurs, directement dans le contexte d'un tissu de souris fraîchement isolées. Le test repose sur les marqueurs de surface cellulaire CD71, Ter119, et sur la cytométrie en flux "en avant-scatter" paramètre, qui est fonction de la taille des cellules. Le dosage de CD71/Ter119 peut être utilisé pour étudier les progéniteurs érythroïdes au cours de leur réponse au stress érythropoïétique in vivo, par exemple, chez la souris anémiques ou souris logés dans des conditions pauvres en oxygène. Il peut également être utilisée pour étudier les progéniteurs érythroïdes directement dans les tissus de souris adultes génétiquement modifiés ou des embryons, afin d'évaluer le rôle spécifique de la voie moléculaire modifiée dans l'érythropoïèse.
Protocole
1. La récolte des tissus
- Préparer des tubes contenant 2 à 5 ml tampon de coloration à froid (tampon phosphate salin (PBS) avec ajout de BSA 0,2% et glucose 5 mM). Garder les tubes sur la glace avant la récolte des tissus.
- Cull souris selon le protocole approuvé approprié (par exemple le CO 2 par inhalation suivie de dislocation cervicale).
- Prélever du sang par ponction cardiaque sur EDTA ou héparine de collecte de sang pour une analyse ultérieure des tubes, par exemple, de l'hématocrite, numération des réticulocytes ou l'analyse de la SRC.
- Récolte de la rate et des os, des tissus de placer de chaque souris dans un t....
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Discussion
La méthodologie cytométrie en flux permet l'étude simultanée de toutes les fonctions cellulaires qui peuvent être détectées avec un anticorps conjugué à fluorescence spécifique ou ligand, y compris les marqueurs de surface cellulaire, l'expression des protéines, la survie cellulaire, signalisation cellulaire en utilisant des anticorps phospho-spécifiques 3 et l'état du cycle cellulaire. Ces mesures peuvent être effectuées dans chacun d'un nombre de différenciation au stade des sous-ensembles s.......
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Déclarations de divulgation
Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par l'Université du Massachusetts Medical School comité IACUC.
Remerciements
Nous remercions le cœur des flux UMass cytométrie: Richard Konz, Ted Giehl, Barbara Gosselin, Yuehua Gu et Tammy Krupoch. Ce travail a été financé par le NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS) et le NIH CA T32-130 807 (JRS). Les ressources de base soutenu par le diabète de recherche en endocrinologie Centre DK32520 subventions ont également été utilisés.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Société | Numéro de catalogue | |
| Fas-biotine | BD Pharmingen | 554256 | |
| Streptavidine-APC | Molecular Probes | S868 | |
| 40 um tamis cellulaire stérile | Fisherbrand | 22363547 | |
| Polystyrène fond rond tubes pour la coloration FACS | BD Falcon | 352008 | |
| À fond en U 96 puits | BD Falcon | 353910 | |
| ChromePure IgG de lapin | Jackson ImmunoResearch | 015-000-003 | |
| CD71-FITC (stock 0.5mg/ml) | BD-Biosciences | 553266 | |
| Ter119-PE (stock 0.2mg/ml) | BD-Biosciences | 553673 | |
| 7AAD | BD-Biosciences | 559925 | |
| DAPI en poudre | Roche | 236276 | |
| Rat FITC anti-souris CD41 MWReg30 | BD Pharmingen | 553848 | |
| Rat FITC anti-souris CD45R/B220 RA3-6B2 | BD Pharmingen | 553087 | |
| Rat FITC anti-souris CD411b/Mac-1 M1/70 | BD Pharmingen | 557396 | |
| Rat FITC anti-souris Ly-6G et Ly-6C (GR-1) RB6-8C5 | BD Pharmingen | 553126 | |
| Hamster FITC anti-souris CD3e 145-2C11 | BD Pharmingen | 553061 | |
| APC kit de BrdU débit | BD Pharmingen | 557892 | |
| Annexine V-biotine | BD Pharmingen | 556418 |
Références
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