كان يعمل الإلكترون ممغطس صدى (EPR) التحليل الطيفي للكشف عن اكسيد النيتريك من الخلايا البطانية الأورطي البقري وأنيون دسموتاز الراديكالية من العدلات الإنسان باستخدام الحديد (II)-N-ميثيل-D-glucamine dithiocarbamate، الحديد (مليون جالون يوميا) 2 و 5،5، ثنائي ميثيل-1-pyroroline-N-أكسيد، DMPO، على التوالي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
اكتشاف اكسيد النيتريك وانيون الراديكالي فوق الأكسيد بواسطة الكترون ممغطس التحليل الطيفي بالرنين من الخلايا باستخدام الفخاخ سبين
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
النتروجين التفاعلي / أنواع الاكسجين (ريوس / RNS) بتركيزات منخفضة تلعب دورا هاما في تنظيم وظيفة الخلية، مما يشير، واستجابة جهاز المناعة ولكن في تركيزات غير المنظم تضر بقاء الخلية 1 و 2. في حين أن الأنظمة الحية تطورت مع الداخلية وآليات الدفاع المضادة للأكسدة الغذائية لتنظيم روس جيل، ويتم إنتاج ريوس مستمر وكأنها أمر طبيعي والمنتجات من عملية التمثيل الغذائي العادي للأوكسجين ويمكن أن يسبب الضرر التأكسدي للالجزيئات الحيوية مما يؤدي إلى فقدان وظيفة البروتين وانقسام الحمض النووي، أو دهن بيروكسيد 3، و في نهاية المطاف إلى الاكسدة مما أدى إلى إصابة أو موت الخلية 4.
أنيون دسموتاز الراديكالية (O 2 • -) هو مقدمة كبيرة لبعض من أكثر الأنواع المؤكسدة للغاية تعرف أنها موجودة في النظم البيولوجية مثل peroxynitrite والهيدروكسيل. جيل من O 2 • - يشير إلى أول بادرة من انفجار الأكسدة، وبالتالي، أناTS كشف و / أو عزل في النظم البيولوجية هو المهم. في هذه المظاهرة، O 2 • - قد ولدت من العدلات النوى (PMNs). من خلال تحفيز الكيميائي مع phorbol-12-myristate-خلات-13 (PMA)، PMN يولد O 2 • - عن طريق تفعيل أوكسيديز نيكوتيناميد ثنائي النوكليوتيد الأدينين (NADPH) فوسفات 5.
أكسيد النيتريك (NO) سينسيز والتي تأتي في ثلاثة الأشكال الإسوية، ومحرض، العصبية، وNOS البطانية، أو iNOS، nNOS أو أنوش، على التوالي، ويحفز على تحويل أرجينين-L إلى L-سيترولين، وذلك باستخدام لإنتاج NADPH رقم 6 . هنا، ولدت لدينا أي من الخلايا البطانية. في ظل ظروف الاكسدة، يمكن أنوش على سبيل المثال التحول من إنتاج NO إلى O 2 • - في عملية تسمى uncoupling، التي يعتقد أن سببها أكسدة الهيم (7) أو المشارك عامل، tetrahydrobiopterin (BH 4) 8.
هناك عدد قليل فقطوتقتصر وسائل موثوق بها للكشف عن الجذور الحرة في النظم البيولوجية ولكن عن طريق خصوصية وحساسية. ويشيع استخدام تعويض اللون تدور لتحديد الجذور الحرة وينطوي على رد فعل جذري إضافة إلى فخ تدور تشكيل معقد إضافي تدور الثابتة، ويمكن الكشف عنها بواسطة التحليل الطيفي الإلكترون ممغطس (EPR) صدى. وadducts مختلف جذري معرض طيف المميزة والتي يمكن استخدامها لتحديد الجذور التي يتم توليدها ويمكن أن توفر ثروة من المعلومات عن طبيعة وحركية الإنتاج جذري 9.
وقد تم في nitrones دوري، 5،5، ثنائي ميثيل-بيرولين-N-أكسيد، DMPO 10، DEPMPO فسفوريل-استبدال 11، واستر، بديلا، EMPO 12 و BMPO 13، استخدمت على نطاق واسع الشراك تدور - تدور الأخير الفخاخ واظهار أطول فترة منتصف العمر لO 2 • - معقد إضافي. الحديد (II)-N-ميثيل-D-glucamine dithiocarbamate، الحديد (مليون جالون يوميا) 2 </ يستخدم عادة> الباطن إلى اعتراض NO نظرا لارتفاع معدل تكوين معقد إضافي واستقرار عالية للناتج إضافة زيادة ونقصان 14.
البروتوكول
1. ثقافة خلايا الشريان الأورطي البقري غشائي (BAEC)
- وتم اتباع تقنيات التعقيم المناسبة.
- في وسط المياه، وحمام دافئ بدون المضادات الحيوية عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: المتوسط ويتكون من الفينول المتوسطة Dulbecco لتعديل النسر الحر (DMEM) مع 4،5 غ / ل D-جلوكوز، 4 مم L-الجلوتامين، 1٪ غير الاساسيين من الأحماض الأمينية، على أن تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 2.5 ملغم / لتر عامل نمو بطانة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
واستخدمت EPR محاصرة تدور في مجموعة واسعة من التطبيقات الطبية الحيوية لقياس وتحديد الجذور الحرة. محاصرة تدور حساس جدا، وقادرة على الكشف عن الجذور بتركيزات تتراوح بين نانومتر إلى ميكرومتر مما يجعلها مناسبة للتطبيق في النظم البيولوجية. تشكيل معقد إضافي متوازي المغنطيسية، NO-FE-2 + مليون جالون يوميا، هو اساس عدم الكشف عن طريق الجيش الشعبي الثوري. FE-2 + مليون جالون يوميا يتفاعل بسرعة مع 18 NO بمعدل ~ 10 6 م -1 ث -1. .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة القومي للقلب والرئة والدم المعهد منحة RO1 HL81248.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليق (اختياري) |
| الفينول المتوسطة DMEM مجانا ارتفاع الجلوكوز 1X | GIBCO | 31053 | |
| 0.25٪ التربسين-EDTA | GIBCO | 25200 | |
| L-الجلوتامين | فيشر العلمية | BP379-100 | |
| MEM غير الأحماض الأمينية الأساسية | GIBCO | 11140 | |
| الأبقار مصل الجنين | اتلانتا البيولوجية | S11550 | |
| عامل النمو البطاني | ميليبور | 02-102 | |
| تساى | انزو العلوم الحياتية | A-23187 | تذوب في DMSO |
| SIN-1 | انزو العلوم الحياتية | BML-CN245-0020 | |
| DMPO | Dojindo مختبرات | D048-10 | |
| FeSO 4 0.7 H 2 O | سيجما ألدريتش | 215422-250G | تذوب في برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم والماغنسيوم |
| مليون جالون يوميا | انزو العلوم الحياتية | ALX-400-014-M050 | تذوب في برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 + |
| BAEC الخلايا | خلية أنظمة | 2B2-C75 | |
| DMSO | فيشر العلمية | BP231-100 | |
| DPBS | سيجما ألدريتش | D8537 | |
| DPBS مع CaCl 2 و 2 MgCl | سيغما Aldrich | D8662 | |
| Phorbol-myristate خلات (PMA) | سيجما ألدريتش | 79346-1MG |
المراجع
- Winterbourn, C. C. Reconciling the chemistry and biology of reactive oxygen species. Nat. Chem. Biol. 4, 278-286 (2008).
- Winterbourn, C. C., Hampton, M. B. Thiol chemistry and specificity in redox signaling. Free Radic. Biol. Med. 45, 549-561 (2008).
- <....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
