정량 PCR을 사용하여, 우리는 잘 설립된 여자 CAM 모델이 양적 먼 기관으로 인간의 종양 세포의 전이를 분석하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
전이 암 세포가 일차 종양에서 보급하는 동안, 주위 조직으로 침범하고, 멀리 떨어진 장기로 확산. 전이는 많은 조직 유형, 기간 변수 기간을 포함하고 자주 어려운 조사 수치 만들기, 장기 이내 깊은 발생할 수 복잡한 과정이다. 또한, 전이성 프로세스의 효능이 어려운 종양 세포 행동의 단일 측면의 기여를 평가하는 전이성 폭포의 여러 단계에 의해 영향을받습니다. 그 결과, 전이의 assays 자주 전이를 공부하는 반드시 현실 컨텍스트를 제공하기 위해 실험 동물에서 수행됩니다. 불행히도,이 모델은 더 이상 자신의 복잡한 생리학에 의해 복잡하게됩니다. 여자의 난자는 chorioallantoic 멤브레인 (CAM), 종양 세포의 xenografting에 수용되는 달걀 껍질 아래에있는 잘 vascularized 엑스트라 배아 조직의 접근으로 인해, 전이를 공부하는 많은 한계를 극복 생체내 모델에서 독특한 (그림 1). 또한, 여자는 배아가 자연스럽게 immunodeficient이기 때문에, CAM은 쉽게 정상과 종양 조직 모두의 engraftment을 지원합니다. 가장 중요한 조류 CAM 성공적으로 성장, 침공, angiogenesis, 그리고 microenvironment의 개조를 포함하여 대부분의 암 세포 특성을 지원합니다. 이것은 암 전이로 이어질 가능성과 새로운 치료제로 전이성 암의 반응을 예측하는 경로의 조사를 위해 모델이 매우 유용합니다. 종 특정 Alu PCR에 의해 전파 세포의 검출은 양적 25 세포처럼 몇 가지에 의해 식민지 아르 장기 전이를 평가하는 것이 가능합니다. 인간 표피 암종 세포 라인 (HEp3)를 사용하여 우리는 여자의 간, 폐를 포함하여 먼 장기에 암 세포의 자발적인 전이를 분석이 모델을 사용합니다. 또한, Alu - PCR 프로토콜을 사용 우리는 전이의 개별 요소 intravasation, 체포, 넘쳐 흐름, 그리고 식민을 분석하고 quantitate하는 도구로 감도와 분석의 재현성을 보여줍니다.
프로토콜
1. xenografting 위해 달걀 (자발적인 전이)를 준비
- 갓 수정된 닭고기 달걀은 10 100 ° F에서 일 및 60 %의 습도에 대한 회전 배양기에 incubated 수 있습니다. 계란 4 번 각각의 시간을 회전하고 있습니다.
- 발달 10 일째에 계란은 계란 선반에 그들의 측면에 표시됩니다. 거위 목 램프 또는 기타 적합한 광원은 airsac가있는 계란의 뭉툭한 끝에 달걀 껍질에 빛을 빛나는하여 촛불 달걀을하는 데 사용됩니다.
- chorioallantoic 정맥이 위치하고 표시됩니다. 이 정맥은 그것이 몇 가지 큰 혈관의 교차점입니다 달걀 껍질의 상단에 위치하고 있습니다. 이 지점 시점에서 혈관은 CAM 멀리 아래로 방울 및 배아에 연결됩니다. 1cm 사각형 상자가 정맥의 분기점에서 약 1cm 떨어진 달걀 껍질에 연필로 그린 것입니다. 를 포함하고 광장 주변 지역은 다음 요오드에 배어 면봉을 사용하여 청소합니다.
- 실리콘 카바이드 숫돌 (Dremel 부분 # 84922) 구멍이 공기 색으로 계란의 뭉툭한 끝 통해 뚫고있다가 장착되어 회전 절삭 도구 (Dremel)를 사용합니다. 이 같은 도구를 사용하여 구멍은 달걀 껍질 막의 짧은 중지, 계란 위에 이전에 그려진 사각형 안에 뚫고있다. 끝에 훌륭한 버와 25 게....
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토론
병아리 CAM은 암 생물학과 전이성 진행의 다양한 측면을 연구하기위한 모델 시스템으로 수십 년 동안 사용되었습니다. 전이성 능력 원리 평가는 휴면의 분석을 포함하는 그룹의 다양한하여이 모델에서 수행되었습니다 (. 아귀레 Ghiso 외, 1999; Ossowski과 제국, 1983), 조직 개조 (Deryugina 외, 2005;. 안 - Dantona . 외, 1999), 그리고 전이 (Zijlstra 외, 2008;. Zijlstra 외, 2002).. 그것은 사용하기 때문입니다 자사의 용이성, xenografts를 수락하기 위해 능력의 암 생물학을위한 매우 매력적인 모델을 계속하며, 저렴한 비용 (챔버 외, 1982;. 챔버 외, 1990).. 인간의 구체적인 Alu 기반의 정량 PCR (.. 김 외, 1998; Zijlstra 외, 2002)를 사용하여 우리는 인간 cpiderm.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 아낌없이 수정된 난자를 제공 타이슨 식품 주식 회사를 인식 싶어요. 샨나 아놀드는이 프로토콜을 찍는 동안 계기되었다. Trenis 팔머는 루스 L. Kirschstein 내셔널 리서치 서비스 수상 (F31 국립 암 연구소)에서 국립 보건원에 의해 지원되었다. 이 작품은 부분적으로 CCSRI 부여 # 700537 JDL 및 NIH / NCI 부여 # CA120711 - 01A1 및 AZ로 CA120711 - 01A1에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 (옵션) |
| 1X Dulbecco의 수정 이글 중간 (DMEM) | Invitrogen | 11995073 | |
| Dulbecco의 인산 버퍼 살린 (D - PBS) (1X), 액체 | Invitrogen | 14190250 | 산도 7.4 |
| 트립신, EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 4Na와 0.05 % (1X), 액체 | Invitrogen | 25300054 | |
| 스포츠먼 해처 | 베리 힐 | 1550HA | 이러한 incubators는 가장 쉽게 사용할 수 몇 가지 있습니다. 그러나 비디오는 다른 장비를 보여줍니다. |
| 스포츠먼 인큐베이터 | 베리 힐 | 1502EA | |
| Dremel 회전 공구 | Dremel | ||
| 더 Dremel 커토프 바퀴 없습니다. 36 | Dremel | 409 | |
| 휴대용 피펫 에이드 | 어부 | 1368115E | |
| 커튼 Applicators를 스쳐 | 어부 | 23-400-001) | |
| 수정된 계란 | 여러 | 여러 공급 업체가 사용할 수 있습니다. 계란은 약 35-55그램해야합니다. 그들이 나이 36 사이 55주해야 낳는 암탉. | |
| Hemocytometer | Hausser 과학, VWR | 15170-090 | |
| 광섬유 현미경 조명기 | Amscope | HL250 - AY | 150W |
| 25 게이지 바늘 | |||
| Sybr 그린 추출 - N - 앰프 조직 PCR 키트 | 시그마 - 알드리치 | XNATRG |
참고문헌
- Ghiso, A. guirre, Kovalski, J. A., K,, Ossowski, L. Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling. J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).
- Chambers, A. F., Shafir, R., Ling, V.
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