Выделение и характеристика РНК-содержащих экзосом

Summary

Эта статья демонстрирует методы выделения, очистки и обнаружения экзосом, а также методы анализа их молекулярной содержания. Эти методы могут быть адаптированы для exosome изоляции от обеих культуры клеток и биологических жидкостей, и может за анализ молекулярных содержание также может быть полезно в функциональных исследований.

Abstract

Область исследований экзосом быстро расширяется, с резким увеличением публикаций в последние годы. Эти небольшие везикулы (30-100 нм) эндоцитарного происхождения впервые были предложены для того, чтобы ретикулоциты могли эрацировать рецептор трансферрина при созревании в эритроциты¹, а позже были названы экзосомами. Экзосомы образуются путем отпочковывания внутрь поздних эндосом, образующих мультивезикулярные тельца (MVB), и высвобождаются в окружающую среду путем слияния MVB с плазматической мембраной². С момента первого открытия экзосом было показано, что широкий спектр клеток высвобождает эти везикулы. Экзосомы также были обнаружены в нескольких биологических жидкостях, включая плазму, жидкость для промывания носа, слюну и грудное молоко^3-6. Кроме того, было продемонстрировано, что содержание и функция экзосом зависят от исходной клетки и условий, при которых они производятся. Для экзосом были продемонстрированы различные функции, такие как индукция толерантности к аллергену^7,8, эрадикация установленных опухолей у мышей⁹, ингибирование и активация естественных клеток-киллеров^10-12, стимулирование дифференцировки в Т-регуляторные клетки¹³, стимуляция пролиферации Т-клеток¹⁴ и индукция апоптоза Т-клеток¹⁵. В 2007 году мы продемонстрировали, что экзосомы, высвобождающиеся из тучных клеток, содержат матричную РНК (мРНК) и микроРНК (микроРНК), и что РНК может передаваться из одной клетки в другую через экзосомы. Было показано, что в клетках-реципиентах мРНК, переносимая экзосомами, транслируется в белок, что указывает на регуляторную функцию перенесенной РНК¹⁶. Кроме того, мы также показали, что экзосомы, полученные из клеток, выращенных в условиях окислительного стресса, могут вызывать толерантность к дальнейшему стрессу в клетках-реципиентах и, таким образом, предполагают биологическую функцию экзосомальной челночной РНК¹⁷. Среды для культивирования клеток и биологические жидкости содержат смесь везикул и отслаивающихся фрагментов. Таким образом, высококачественный метод выделения экзосом с последующей характеристикой и идентификацией экзосом и их содержимого имеет решающее значение для отличия экзосом от других везикул и частиц. В данной работе мы представляем метод выделения экзосом как из среды клеточных культур, так и из жидкостей организма. Этот метод выделения основан на повторяющихся этапах центрифугирования и фильтрации, за которыми следует заключительная стадия ультрацентрифугирования, на которой экзосомы гранулируются. Выделены важные методы идентификации экзосом и характеристики экзосомальной морфологии и содержания белков, включая электронную микроскопию, проточную цитометрию и вестерн-блоттинг. Очистка общей экзосомальной РНК основана на хроматографии спиновой колонки, а выход экзосомальной РНК и распределение по размерам анализируются с помощью биоанализатора.

Protocol

1. Exosome изоляции

1. Рост клеток в среде с exosome без сыворотки. Таким образом, любая сыворотку добавляют к среде, культуре клеток должна быть обедненной экзосом ультрацентрифугированием на 120 000 мкг в течение ночи при 4 ° С до использования.
2. Передача клеточной суспензии для конических труб.
3. Центрифуга при 300 мкг в течение 10 минут при температуре 4 ° С до гранул клеток.
4. Передача супернатант в ультрацентрифуге труб и, если не полностью заполнены добавить PBS.
5. Центрифуга образца при 16 500 мкг в течение 20 минут при температуре 4 ° C для дальнейшего удаления клеток и клеточных обломков.
6. Фильтры супернатанта через 0,2 мкм фильтр для удаления частиц размером более 200 нм.
7. Передача фильтруется супернатант новые трубы ультрацентрифуге и уплотнения труб до ультрацентрифуге на 120 000 мкг в течение 70 минут при температуре 4 ° С до гранул экзосом.
8. Удалите супернатант.
9. Для максимального извлечения exosome, ресуспендируют exosome обогатитьред гранул раз в небольшом объеме (~ 3 х 50 мкл) соответствующего буфера. Этот буфер зависит от того, ниже по течению эксперименты планируются следующие exosome изоляции. Например, лизис буфер используется для белка и РНК изоляции, PBS используется для электронной микроскопии и проточной цитометрии и функциональной среды для исследования могут быть предпочтительнее.

Обратите внимание, экзосом также может быть изолирован от различных жидкостей организма, таких как плазма, используя ту же процедуру, как для средств массовой культуре клеток. Для вязких жидкостей может быть необходимо, чтобы разбавить образец PBS до центрифугирования и фильтрации шаг. В связи с центрифугирования скорость пунктом 5 выше, она может быть увеличена до 29 500 мкг, а ультрацентрифугирования в пункте 7 может быть продлен до 90 минут ^18.

Если проба должна быть дополнительно очищают exosome гранулы могут быть плавали на градиенте сахарозы и экзосом будет в первую очередь найти во фракции representing плотность 1.13-1.19 г / мл ^2.

2. Exosome идентификации с помощью электронной микроскопии

1. Чтобы продолжить работу по ликвидации загрязняющих белков, ресуспендируют exosome обогащенного гранул в ФБР и ультрацентрифуге на 120 000 мкг в течение 70 минут при температуре 4 ° С до повторного гранул экзосом.
2. Возьмите небольшую аликвоту образца для выделения белка и измерение общего белка. Убедитесь, что только небольшая часть образца лизируются и используется для измерения белка и сохранить нетронутым экзосом, решаются в PBS, отдельный на льду или при температуре -80 ° С для дальнейших экспериментов.
3. Место падения, примерно 10 мкг exosomal белка нетронутыми экзосом ресуспендировали в ФБР, на парафильмом. Затем пинцетом, осторожно позицию углерода формвар покрытые сеткой никеля на вершине каждой капле в течение 30-60 минут. Убедитесь, что сетка находится с покрытием стороной падение содержащие экзосом.
4. Место три капли, каждый 30 мкл, ФСБ по тон парафильмом и промыть сетку последовательно позиционирования сетки в верхней части капли PBS, а также использовать поглощающие бумаги между ними. Используйте бумагу аккуратно поглощать просто держа его близко к стороне сетки, без контакта с покрытием территории.
5. Fix образца депозит капли 2% параформальдегида на парафильмом и место сетки поверх падение на 10 минут.
6. Повторите промывание шаг в точке 4, до иммуноокрашивания с соответствующим антителом. Обычно используются антитела анти-CD63 и анти-класса MHC II. Электронная микроскопия может быть выполнена без иммуноокрашивания как экзосом могут быть определены только в зависимости от размера и морфологии. Однако, мы рекомендуем для оценки размера, морфологии и наличие мембранного белка для более убедительных проверки.
7. Передача сетки 30 мкл капли первичных антител выбора и инкубировать в течение 40 минут. Вымойте, повторяя точку 4, но используют 0,1% бычьего сывороточного альбумина в PBS вместо PBS в одиночку.
8. Повторите пункт 7, но с 10 нм золота меченых вторичных антител и промыть PBS в одиночку.
9. После исправления образца, добавив каплю 2,5% глутаральдегида для парафильмом и инкубировать сетку поверх падение на 10 минут. Повторите мыть в пункте 4, но использовать пять капель деионизированной воды вместо трех капель ФСБ.
10. Контрастность образец путем добавления капли 2% уранилацетата к парафильмом и инкубировать сетку поверх падение на 15 минут.
11. Вставить образец путем добавления капли 0,13% метилцеллюлозы и 0,4% уранилацетата к парафильмом и инкубировать сетку поверх падение на 10 минут.
12. Удалите излишки жидкости, осторожно использованием поглощающих бумаги, прежде чем позиционирования сетки на бумаге с покрытием вверх и дайте ему высохнуть на воздухе в течение 5 минут.
13. Изучение препаратов с помощью электронного микроскопа и не храните сеток в сетку поле для будущей работы.

3.Exosome характеристику с помощью проточной цитометрии

Как экзосом слишком малы, чтобы быть обнаружены с помощью существующего оборудования проточной цитометрии, необходимо прежде не свяжет экзосом на антитела покрытием шариков (рис. 1). Эти шарики могут быть приобретены как готовый продукт или сделаны в лаборатории с антителом выбора. В зависимости от сотовой exosomal происхождения, различных антител может быть связан с бисером, который может быть либо магнитных или латекс характер. Мы в настоящее время используют анти-MHC класса II или анти-CD63 покрытием шарики для этого анализа.

1. Для использования "домашнее", покрытые антителом бусы, мы используем 4 мкм бисером латекса покрыты анти-CD63 антител. Вымойте 25 мкл 4 мкм латекса бисером (30 х 10 ⁶ бусин) два раза в 100 мкл буфера MES, 3 000 мкг в течение 15-20 минут и растворится осадок в 100 мкл буфера MES. Подготовка смеси, содержащей антитела, объем, равный 12,5 мкг антител с тем же объемом буфера MES. Добавитьбусы смесь антител и инкубировать при перемешивании в течение ночи при комнатной температуре. Вымойте покрытые антителом бисером три раза PBS (3 000 мкг в течение 20 минут) и растворяют осадок в 100 мкл буфера хранения (с конечной концентрации 300 000 бусин / мкл).
2. Для каждого образца (каждое антитело), ​​перейдите объем, равный не менее 30 мкг exosomal белка (интактного экзосом решена в PBS) в ~ 100 000, покрытые антителом бисером.
3. Инкубируйте экзосом и бисером, в общем объеме 300 мкл PBS, в течение ночи при 4 ° С при легком движении.
4. Блок, добавив 300 мкл 200 мМ глицин и инкубировать в течение 30 минут.
5. Вымойте exosome-бусинки комплексы дважды в промывочный буфер (1-3% в сыворотке PBS), 600 мкг в течение 10 минут.
6. Инкубируйте exosome-бусинки комплексов с 50 мкл антител IgG при 4 ° C. Вымойте exosome-бусинки комплексы дважды в промывочный буфер, как описано в шаге 5.
7. Добавить 90 мкл промывочного буфера и 10 мклантитела выбора (в идеале анти-CD9, анти-CD63 или анти-CD81), чтобы exosome-бусинки комплексов и инкубировать 40 минут при легком движении. Вымойте exosome-бусинки комплексов в два раза в промывочный буфер, как описано в шаге 5.
8. Добавить 300 мкл промывочного буфера и получить данные с помощью проточной цитометрии.

Как уже говорилось выше, различные бусины могут быть использованы, например, латекс бисером, как описано в протоколе или магнитные шарики. Если магнитных гранул используются вместо этого, обратите внимание, что протокол будет несколько иным. Блокирование шагом (точка 4) не требуется, и мыть осуществляется путем размещения трубки в магнитное стоять вместо центрифугирования.

Хранения буфера для "домашнего", покрытые антителом бусы, содержит 0,1% глицина и 0,1% натрия azid в ФБР, с рН 7,2.

Важно отметить, убедитесь, что используете exosome обедненного сыворотки для мытья проточной цитометрии буфера (1-3% сыворотки в PBS), чтобы избежатьсыворотке экзосом загрязняющих анализа.

Обратите внимание, при выполнении exosome характеристику с помощью антител, связанных бисером, важно признать, что только конкретные субпопуляции, специфические для антител использовали, то есть выделен и охарактеризован.

4. Exosome обнаружения иммуноблоттинга

Вестерн-блот представляет собой хорошо отработанную метод, и мы не будем вдаваться в подробности относительно самого метода, а сосредоточьтесь на важность подходящую изоляцию белка до иммуноблоттинга и различных антител используется.

1. Растворите exosome пеллет в буфере белка лизис выбор и пипеткой тщательно, а затем вихревого смешивания. Для дальнейшего лизировать экзосом, разрушать ультразвуком образца на водяной бане 3 х 5 минут с вихревыми смешивания между ними. Наконец центрифуги образца, 13 000 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре, и передача супернатант в новую пробирку Эппендорф.
2. Measuповторного общего белка методом выбора и загрузки 20-50 мкг белка на лунку.
3. Отдельный и передачи белков методом электрофореза геля и electroblotting.
4. Блок и мыть мембраны перед выполнением иммунной против белков, обогащенный экзосом.
5. Обнаружение специфического белка по хемилюминесценции, цифровой системой обработки изображений и анализа программного обеспечения.

Как Есть нет exosome специфические маркеры, белки, которые обогащены экзосом, из всех различных клеточных происхождения, которые обычно используются для exosome обнаружения. Это белки, такие как tetraspanins (например CD9, CD63 и CD81), цитоскелет связанных белков (например, Эзрин) и белков, участвующих в мультивезикулярные биогенеза (например Tsg101 и Аликс). Другие белки, которые также часто обнаруживается в экзосом являются Flotillin, Hsc70 и различных белков раб и т.д. Однако, Есть также клетка конкретных белков, обнаруженных в экзосом таких как А33 (кишечные эпителиальные клетки), CD3(Т-клетки) и MHC класса II (антиген представляющих клеток). Таким образом, в зависимости от от того, что тип клеток экзосом освобождаются от маркеры для обнаружения может изменяться.

Как и другие отсеки ячейки также могут производить пузырьки, он также рекомендовал, чтобы определить присутствие белков из этих отсеков, таких как эндоплазматическая сеть (например, calnexin и GRP78) и аппарат Гольджи (например, GM130). Таким образом, отсутствие этих белков указывает на отсутствие или мало загрязнения пузырьки других отсеков в исследуемом образце.

5. Выделение exosomal РНК и РНК анализа

1. Растворите exosome пеллет в буфере РНК лизис выбора и выполнения выделения РНК. Различные комплекты изоляции РНК могут быть использованы в зависимости от течения экспериментов, но колонки методы, основанные предоставляет образцы с более широким спектром РНК. Мы в настоящее время используют miRCURY РНК Изоляция Kit от Exiqon, но и другие комплекты могут быть пригодны в зависимости от SCientific вопрос на руку.
2. При выполнении изоляции РНК важно для работы в РНКазы свободной среде. Поэтому использование нуклеиновых кислот и нуклеаз свободной наконечники и протрите обе скамейки и оборудование свободным от загрязнений и РНКазы.
3. Для выделения РНК с помощью РНК miRCURY Изоляция Kit, растворить exosome осадок в 350 мкл лизирующего раствора и выполняют вихревого перемешивания в течение 15 секунд.
4. Добавить 200 мкл 95% этанола и вихревого смешивания в течение 10 секунд.
5. Место колонку в пробирку и передачи лизировали экзосом к колонне и центрифуги 1 минуты при 14 000 х g.
6. Промыть три раза, добавив 400 мкл промывочного раствора в колонну, содержащую exosomal РНК и центрифуги в течение 1 минуты при 14 000 х g.
7. Центрифуга колонку в течение 2 минут на 14 000 мкг, чтобы убедиться, что столбец является сухой и места сухие колонки в РНКазы без трубки Эппендорф.
8. Добавить 50 мкл буфера элюции с колонки и центрифуги в течение 2 минут при 200 мкг, затем по 1 минуте на 14 000 х g.
9. Продолжить с изолированной РНК или хранить его в -80 ° C.

Для выявления и анализа извлеченных общего exosomal РНК, использование Agilent 2100 Bioanalyzer с 6000 Nano РНК или РНК, 6000 Пико Kit. Анализ показывает, exosomal выход РНК и распределение по размерам.

6. Представитель Результаты

Экзосом слишком малы, чтобы быть обнаружены с помощью доступных методов проточной цитометрии, и поэтому придает антителами бисер перед анализируемой (рис. 1). Как exosome-бусинки комплексы могут объединять разброс проточной цитометрии сюжет может содержать различные популяции одноместные, двухместные и трехместные бусины (рис. 2A). Стрелка указывает одно бисера, которые в дальнейшем анализе. CD63 положительных одного из бисера exosome населения по сравнению с его изотипа управления показана на рисунке 2B.

e_content "> Из-за небольшого размера экзосом, они могут быть только непосредственно визуализируются с электронной микроскопии, а не с помощью световой микроскопии. Типичные морфологические характеристики экзосом круглой формы и 30-100 нм размеров пузырьков мембраны. На рисунке 3, электронная микроскопия фотографии показывают экзосом immunostained () с золотой меченные антитела для CD63 (указано стрелкой) и не immunostained экзосом (B).

Установить, что изолированные пузырьки действительно экзосом и дальнейшего характеризуют exosomal белков, иммуноблоттинг обычно используется. Рисунок 4 показывает отсутствие calnexin, эндоплазматический ретикулум маркером. Это указывает на то немного загрязнения пузырьки из эндоплазматического ретикулума. Кроме того, на рисунке 4 показана присутствий CD81 в экзосом, который tetraspanin обычно обогащенный экзосом.

Сотовая РНК в основном содержатс рибосомной РНК (рРНК), который рассматривается как две видные пики для 18S и 28S рРНК подразделений в анализе Bioanalyzer (рис. 5А). Тем не менее, exosomal РНК отличаются по своему профилю, как экзосом отсутствие двух рРНК пиков (18S и 28S) и обогащены короткие РНК, таких как РНК и микроРНК (рис. 5В).

Рисунок 1. Из-за небольшого размера экзосом (30-100 нм), они не могут отличить от шума и фона, когда анализировали с помощью проточной цитометрии. Таким образом, необходимо приложить их к покрытые антителом бисера перед экзосом анализируются, которые затем могут быть визуализированы лазера.

Рисунок 2. Exosome-бусины комплекс может объединять друг с другом и образуют двойные и тройные шарики (). Стрелка демонстрирует одну бусинку-экзо некоторые населения, которая закрытого типа, и используются для дальнейшего анализа. Это население будет непосредственно по сравнению с контролем изотипа (заполняется серым пик), чтобы определить наличие мембраны молекулы экзосом. CD63 положительных экзосом (черный открытых пик) показаны на рисунке B.

Рисунок 3. Электронные микрофотографии экзосом с типичной морфологией и размера (40-80 нм) (А и В). Стрелка на рисунке указывает на золотые частицы вторичные антитела, подтверждающие, что это exosome имеют CD63 на поверхности мембраны.

Рисунок 4. Иммуноблоттинг результаты, показывающие отсутствие эндоплазматического ретикулума calnexin белка, но наличие белка обычно обогащенный экзосом, tetraspanin CD81.

ve_content ">
Рисунок 5. Bioanalyzer результаты, показывающие наличие РНК в клетках () и экзосом (B). Стрелки указывает 18S и 28S рРНК подразделения присутствуют в клетках. Как exosomal РНК мужественный содержать мелкие РНК нет или мало рРНК определяется в экзосом.

Discussion

При изучении молекулярной содержание и / или функции экзосом, очень важно использовать метод изоляции высоким качеством, что обеспечивает соответствующую доходности и низкой степени загрязнения. Методологии, описанной в этой статье является хорошо организованной подход для выделения экзосом и изучать их содержание РНК и биологические функции. Кроме того, важность характеристик изолированных экзосом, путем сочетания различных методов, в том числе электронной микроскопии, проточной цитометрии и Вестерн-блот, будет выделен.

При изоляции экзосом, первый шаг центрифугирования (300 мкг) используется для осаждения клеток, которые могут присутствовать в суспензии клеток или изучал биологические жидкости. Второго центрифугирования при потребности 16 500 мкг быть достаточно сильным, чтобы гранулы мертвых клеток, больше мусора, апоптотических тел и других органелл. После этого центрифугирования, некоторые протоколы включают нано-фильтрации шаг, но некоторые инвestigators исключили этот шаг. Тем не менее, мы подчеркиваем важность искоренения фрагменты и пузырьки больше 200 нм, и поэтому настоятельно рекомендую в том числе фильтрация шаг. Если более жесткие изоляция необходима, 100 нм, фильтры могут быть использованы, но учтите, что если вязких жидкостей используются, эти фильтры могут легко стать заблокирован и exosomal материала теряется. Кроме того, 100 нм фильтрации может повлиять на морфологию экзосом, а тем более, если экзосом находятся на большем масштабе они могут быть потеряны. Таким образом, фильтры 200 нм представляется целесообразным для exosome изоляции. После фильтрации, обязательные ультрацентрифугирования в 120000 мкг используется для гранул экзосом. Экзосом могут быть дополнительно промывают PBS, связанных с антителами покрытые бисером и промывают, или разместить на градиенте сахарозы для удаления загрязнения белков. Однако, это может быть очень ресурсоемкой процесс, который мы утверждаем, что нет необходимости, особенно если начать объему образца мала и / или содержание РНК ое экзосом низкий, как дополнительные шаги будут существенно снизить материала в дальнейшем. Однако, опять же, характер изолированных везикул должно быть доказано наличие и отсутствие определенных белков.

На сегодняшний день нет абсолютно уникальный белок маркером экзосом был идентифицирован чтобы убедиться, что образец содержит экзосом и больше ничего. В результате сочетания методов необходимо, чтобы охарактеризовать экзосом, в том числе определение размера и морфологии экзосом помощью электронного микроскопа. Кроме того, чистота образцов может быть определено с помощью электронной микроскопии, так как этот метод может обеспечить обзор уровня загрязнения образцов, например с более крупными пузырьками, такие, как микрочастицы, апоптотических тел или клеточных обломков. Кроме того, содержание белка в экзосом можно определить по проточной цитометрии и иммуноблоттинг и сочетание этих двух методов приводит анализ как мембраносвязанных (например, CD63 иCD81) и внутренним белки (например Tsg101 и Аликс) в экзосом. Обнаружение белков обогащенного экзосом, такие как CD63, Tsg101 и Аликс, и отсутствие белков, таких как эндоплазматическая сеть белка calnexin, является признаком того, что exosome обогащенного гранулы действительно экзосом и не загрязнять пузырьки из других отсеков ячейки.

Профиль РНК, которая обнаруживается в экзосом в корне отличается от подходов, РНК находится в неповрежденных клетках. Таким образом, exosomal РНК проанализированы Bioanalyzer или гель подходы, основанные на РНК анализа отсутствие двух пиков для 18S и 28S рРНК подразделения, которые занимают видное место в анализе клеточных РНК. Поэтому мы утверждать, что обнаружение каких-либо значительных количеств рРНК в пример показывает, что общая РНК извлеченные не из exosomal происхождения одиночку, и, таким образом, что метод изоляции должно быть улучшено и качество гарантировано.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер по каталогу	Комментарии (необязательно)
Exosome изоляции
Optima L-90K ультрацентрифуге	Beckman Coulter	65670
Быстрая печать труб ультрацентрифуге	Beckman Coulter		В зависимости от ротора использовали различные трубы не требуется. Ti70 (342414), Ti45 (345776)
Быстрая печать Беспроводной комплект труб Топпер	Beckman Coulter	358312
Filtropur Шприц фильтр, 0.20μm	Sarstedt	83.1826.001	Для вискозных жидкостей и / или больших объемов, система вакуумной фильтрации, 0,2 мкм, от VWR International можно использовать вместо (514-0600).
Электронная микроскопия
Формвар / углерода покрытием сетки никеля	Тед Пелла Inc	1GN200
Мышь-анти-CD63 человека	BD Bioscience	556019	Заключительные конц: 0.05μg/μl
Изотип контроля; IgG1κ (MOPC 21)	Sigma-Aldrich	M9269	Заключительные конц: 0.05μg/μl
Анти-IgG мыши Золотой конъюгат, 10 нм	Sigma-Aldrich	G7777	Заключительные конца: 1%
LEO 912AB Омега электронного микроскопа	Carl Zeiss NTS		Или эквивалент оборудования.
Проточная цитометрия
4μm aldehyd / сульфат латекса бисером	Динамика межфазной	12-4000
Антитела для покрытия бусин латекса			Например анти-CD63 с BD Bioscience (556019)
Intelli-Mixer RM-2L	ELMI		Или эквивалент оборудования.
IgG из сыворотки крови человека	Sigma-Aldrich	I4506
Антитела для обнаружения	BD Bioscience		Например: ЧП анти-CD63 (556020) PE анти-CD9 (555372) PE анти-CD81 (555676) Изотип управления (555749)
BD FACSAria	BD Bioscience
Вестерн-блот
Трансзвуковой T 490 DH	ELMA		Или эквивалент оборудования.
Выделение exosomal РНК и РНК анализа
miRCURY РНК Изоляция Kit	Exiqon / S	300110
Agilent 2100 Bioanalyzer	Компания Agilent Technologies	G2939A