Summary
Tregs والمكثفات قوية من الجهاز المناعي. هناك عدم وجود علامات سطح فريدة لتعريف بهم ، وبالتالي ، تعريفات Tregs وظيفية في المقام الأول. نحن هنا تصف الأمثل
Abstract
التنظيمية خلايا T (Tregs) هي الحاسمة وسطاء التسامح المناعي في تقرير المصير ، مستضدات. بالإضافة إلى ذلك ، هم المنظمين الحاسمة للاستجابة مناعية بعد العدوى. على الرغم من الجهود المبذولة لتحديد علامة فريدة من نوعها على سطح Tregs ، الميزة الفريدة فقط هو قدرتها على منع انتشار الأسلحة النووية وظيفة الخلايا التائية المستجيب. في حين أنه من الواضح أن المقايسات فقط في المختبر يمكن استخدامها في تقييم وظيفة Treg الإنسان ، وهذا يصبح مشكلة عند تقييم النتائج من دراسات مستعرضة فيها الخلايا السليمة والخلايا المعزولة من الموضوعات مع أمراض المناعة الذاتية (مثل مرض السكري نوع 1 - T1D) الحاجة ويمكن مقارنة. هناك تفاوت كبير بين المختبرات في عدد ونوع من الخلايا التائية المستجيب وطبيعة وقوة التحفيز ، Treg : نسب المستجيب وعدد ونوع من خلايا مولدة تقديم (APC) المستخدمة في قمع الإنسان في فحوصات المختبر. هذا التباين يجعل المقارنة بين الدراسات قياس وظيفة Treg صعبة. الحقل Treg يحتاج الى فحص قمع موحدة من شأنها أن تعمل بشكل جيد مع كل من الاشخاص الاصحاء والمصابين بأمراض المناعة الذاتية. طورنا في الفحص المختبري القمع الذي يظهر القليل جدا من داخل مقايسة التباين في تحفيز خلايا تي المعزولة من المتطوعين الأصحاء مقارنة مع الموضوعات الأساسية تدمير المناعة الذاتية للخلايا البنكرياس β. الهدف الرئيسي لهذه القطعة لوصف تجربة في المختبر قمع الإنسان أن يسمح بإجراء مقارنة بين مجموعات مختلفة الموضوع. بالإضافة إلى ذلك ، هذا الاختبار لديه القدرة على رسم خسارة صغيرة في nTreg وظيفة وتوقع مزيد من الخسائر في المستقبل ، ومن ثم تحديد الموضوعات التي يمكن أن تستفيد من المعالجة المناعية الوقائية 1. أدناه ، ونحن نقدم وصف دقيق للخطوات التي ينطوي عليها هذا الإجراء. نأمل أن تسهم في توحيد في المختبر فحص قمع المستخدمة لقياس وظيفة Treg. بالإضافة إلى ذلك ، فإننا نقدم هذا الاختبار كأداة ليتعرف على الدولة في وقت مبكر من الخلل المناعي والعلامات البيولوجية المحتملة وظيفية للT1D.
Protocol
1. قبل وضع مقايسة القمع ، واحد يحتاج إلى معطف الخرز tosylactivated المضادة للبشرية CD3 (استنساخ UCHT1 ، 1μg/ml تركيز النهائي) لتحفيز الخلية ، وبعد ذلك يتم التحقق مما اذا كانت مغلفة بكفاءة حبات من خلال إنشاء المختبر في فحص انتشار استخدام الإنسان الخلايا التائية
- 1ml من اتخاذ M - 450 قنينة من الخرز tosylactivated الأصلي ، في مكان الوقوف والانتظار حتى مغناطيسي جميع حبات انضمت إلى جانب الأنبوب. إزالة أنبوب العازلة بينما لا تزال في موقف المغناطيسي. اتخاذ موقف من الأنبوب المغناطيسي وإضافة 1ml من buffer1 ، وضع أنبوب في الوقوف مرة أخرى المغناطيسي وإزالة أنبوب buffer1 بينما هو في موقف المغناطيسي ، في 1ml من الخرز buffer1 resuspend وإضافة 40μl المضادة للCD3 الإنسان ، تستنهض الهمم في 37 ° مئوية لمدة 15 دقيقة ، إضافة 0.1 ٪ W / V جيش صرب البوسنة وتواصل التحريض على 16 ساعة القادمة.
- تغسل حبات في buffer2 مرتين لمدة 5 دقائق في 2-8 درجة مئوية ، ومرة واحدة في buffer3 لمدة 5 دقائق في 2-8 درجة مئوية باستخدام الوقوف المغناطيسي كما هو موضح أعلاه ؛ إزالة العازلة وresuspend حبات في 1ml من buffer2 ، والخرز و 4x10 التركيز النهائي 8 / مل وجاهزة للاستخدام.
- قسامة و50000 25000 PBMC / جيد في triplicates في صفيحة 96 - جيدا وإضافة عدد متغير من CD3 المغلفة الخرز (4x10 8 حبات / لتر ، CD3 1μg/ml ، على سبيل المثال 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 حبات / خلية ) من أجل تحديد العدد الأمثل من الخرز لكل خلية. بعد 72 ساعة في الثقافة ، إضافة 1μCi [3 H] ثيميدين ومواصلة احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة المقبلة. خلايا الحصاد في موسم الحصاد لوحة متعددة الشاشات (ميليبور) ، إضافة السائل التلألؤ وقراءة التهم لكل دقيقة (CPM) / أعلى البئر باستخدام NXT عدد (باكارد ، CT). استخدام الخرز / نسبة تكلفة الألف ظهور الخلية عندما هم فوق 5000 ولكن أقل من 15000 لتجنب فرط من Tregs ، والتي قد تفقد وظيفتها القمعية. عادة ، ونسبة 3 حبات / خلية يحفز الخلايا على حد سواء والرد Treg في جميع الفئات الخاضعة اختبارها حتى الان 1-4.
2. PBMC العزلة من الدم الكامل من المتبرعين الأصحاء أو من الإنسان أو leukopacks الغلالة الشهباء (قبل الميلاد) تؤخذ عادة من المتطوعين الأصحاء ومتاحة مجانا من مراكز نقل الدم المحلي (الشكل 1)
- تمييع قبل الميلاد (~ 50ml) 01:06 مع برنامج تلفزيوني (إضافة 250ml). الآن هناك إجمالي حجم 300ml. وأضاف ببطء طبقة 25ml من ق المخفف على رأس 15ml Ficoll - PLUS Paque لأنابيب 50ml فالكون ، من دون إزعاج طبقات. تحولت أجهزة الطرد المركزي في 800xg (1400rpm في جهاز للطرد المركزي Sorvall مع الدوار دلو يتأرجح SH - 3000) لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية ، مع مكابح إيقاف.
- جمع بعناية طبقة PBMC (المرحلة المتوسطة) وتحويلها إلى أنابيب جديدة فالكون 50ml. غسل PBMC عن طريق ملء أنابيب تصل إلى 50ml مع DPBS. جمع الكرات الخلية 2 في أنبوب واحد. الطرد المركزي في 400xg لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. تكرار الغسيل الخطوة مرتين ، كل مرة يجمع بين الكريات الخلية 2 في أنبوب واحد. الجمع بين جميع الكريات الخلية في أنبوب واحد 50ml.
- العد PBMC التريبان باستخدام اختبار استبعاد الأزرق. جعل تخفيف 01:10 في التريبان الأزرق بإضافة 20μl من PBMC ل180μl التريبان الأزرق وصمة عار. تخلط جيدا واتخاذ 20μl الاعتماد في عدادة الكريات على الفور. عد الأرقام من جميع الخلايا الملون غير ملوثين والأزرق فقط وتقع في مبنيين يحتوي كل منها على مساحة 16 متر مربع أصغر. أخذ متوسط كل من الأرقام وتتضاعف بنسبة 10. يقسم هذا العدد بنسبة 100 في الحصول على عدد من PBMC / مل. النسبة المئوية للخلايا قابلة للحياة حساب ك [1 -- (عدد الخلايا الزرقاء / عدد الخلايا الكل) X100]. إذا كان البقاء هو المضي قدما ≥ 95 ٪.
3. MACS قبل نوع من الخلايا التائية CD4
- قبل المتابعة ، ونقل 1ml من PBMC في أنبوب جديد ، إضافة إلى وسائل الإعلام 4ml إعداد الخلايا لتشعيع مع 5000rad ، ستكون هذه مستضد تقديم الخلايا (APC).
- الطرد المركزي بقية الخلايا في 250xg العازلة في PBS/2mM BSA EDTA/0.5 ٪ لل10min في 4 درجات مئوية. من أجل إيقاف الخلايا طاف ، وresuspend 4ml في المخزن المؤقت PBS/2mM BSA EDTA/0.5 ٪.
- إضافة 200μl من microbeads مكافحة MACS CD4 ويحضن في 4 لمدة 20 دقيقة درجة مئوية.
- غسل بإضافة 40ml من العازلة PBS/2mM BSA EDTA/0.5 ٪ ، وأجهزة الطرد المركزي في ل10min 250xg في 4 درجات مئوية. تخلصي وطاف في resuspend 8ml degassed من درجة حرارة الغرفة ، PBS/2mM العازلة BSA EDTA/0.5 ٪.
- مرشح مستقل تعليق الخلية باستخدام مرشحات فصل تمهيدي قبل تحميلها على العمود ليرة سورية.
- انقسام الخلية وتعليق 4ml طبقة معايرة LS كل عمود على (مع 3ml من deggassed PBS/2mM العازلة BSA EDTA/0.5 ٪). يتم إصلاح LS العمود في MidiMACS فاصل. قبل التعليق الخلية نفدت ، إما إعادة تشغيل أو إضافة flowthrough 3ml من درجة حرارة الغرفة العازلة deggassed PBS/2mM BSA EDTA/0.5 ٪ والسماح للتشغيل من خلال العازلة. إضافة المزيد من المخزن حتى يأتي واضحا بها.
- ماصة العازلة deggassed 5ml على العمود LS ، إزالة عمود LS من فاصل MidiMACS ومكان في عالم جديد العقيمة أنبوب جمع 15ml ~ السماح بتشغيل خلال 1.0ml. وضع المكبس في العمود ببطء ودفع بقيةحجم الخروج.
- أن تفعل الشيء نفسه مع كل من الأعمدة ليرة سورية والجمع بين CD4 + two الكسور. إضافة إلى برنامج تلفزيوني وعدد الخلايا 50ml. العائد المتوقع هو ما يصل الى 8 خلايا 5x10. الطرد المركزي في 400xg لمدة 10 دقائق وخلايا resuspend جيدا في 2ml PBS/2mM العازلة BSA EDTA/0.5 ٪.
4. فلوري الفرز الخلية المنشط (FACS) العزلة (الشكل 2)
- جعل مزيج من الأجسام المضادة لعلامات علامات القرص المضغوط إلى سطح الخلية التالية (الحفاظ عليها وحمايتها من الضوء) : 20 ميكرولتر المضادة للبشرية FITC - CD8 (استنساخ RPA - T8) ، و 20 ميكرولتر المضادة للبشرية FITC - CD14 (استنساخ M5E2 ؛ LPS مستقبلات) ، و 20 ميكرولتر المضادة للبشرية CD32 - FITC (استنساخ FLI8.26 ؛ FcγR من النوع الثاني) و 6 ميكرولتر المضادة للبشرية FITC - CD116 (استنساخ M5D12 ؛ GM - CSFRα السلسلة) ، وبدلا من ذلك ، إضافة المضادة 40μl البشرية CD4 - APCCy7 (استنساخ RPA - T4).
- تأخذ 5μl من تعليق خلية 2ml وصمة عار مع 2μl من الكوكتيل وصمة عار ، وهذا هو أنبوب لتحديد العتبة (ناقص واحد ملون تألقي FMO) 5.
- إضافة 50 ميكرولتر المضادة للبشرية CD25 - PE (M - A251 استنساخ ؛ IL - 2Rα) إلى كوكتيل وصمة عار ، وإضافة إلى تعليق الكوكتيل الخلية واحتضان عند 4 درجة مئوية 30 دقيقة. غسل الخلايا في المخزن برنامج تلفزيوني ، الطرد المركزي في 400xg لمدة 10 دقائق وخلايا resuspend إلى تركيز خلية من 10 7 / مل.
- تحضير الخلايا والخلايا غير ملوثين او الخرز الملون ملون تألقي مع واحد بأن يستعمل مثل التعويض عن السيطرة على الخلية الفرز الأغنية FACS دينار بحريني (العلوم البيولوجية ، وسان خوسيه ، ونيو جيرسي).
- الحصول على الخلايا في الأنبوب FMO التي سوف تسمح للمستخدم لتعيين الحد الأدنى لفرز الخلايا CD25 + T (الشكل 2A). مجموعة بوابة FITC سلبية حول الخلايا لاستبعاد FITC إيجابية الخلايا التي تتكون حيدات ، الضامة ، وغيرها من جميع CD4 + T - غير الخلايا (الشكل 2B).
- في مؤامرة منفصلة ، ورسم لبوابات CD25 ، - T CD25low وCD25high خلايا Tregs (أعلى من 1 ٪ من الخلايا معربا عن أكبر عدد من CD25) (الشكل 2C). عادة ما تظهر خلية فرعية عالية النقاء (الشكل 2D ، 2E و2F).
- الطرد المركزي أنابيب جمع مع الخلايا في 400xg لمدة 10 دقائق ، وتبقيهم على الجليد حتى الطلاء.
5. انشاء خلية ثقافة في لوحة 96 - جيدا (مخطط المرفقة بوصفها Table1) في 200μl/well
- 50μl قسامة من CD3 المغلفة الخرز (1 ميكروغرام / مل) محسوبة لتكون 3 حبات / المستجيب خلية في بئر ، معلق في وسائل الإعلام كاملة مع 10 ٪ تجميع المصل AB الإنسان في أسفل U - 96 - جيدا لوحات. (على سبيل المثال ، لجعل وسائل الاعلام مع 2ml CD3 المغلفة ، واتخاذ 7.5μl من المخزون من CD3 المغلفة الخرز النهائي 4x10 تركيز 8 / مل وتمييع 2ml في وسائل الإعلام ، وكل 50μl سيحتوي beads-3beads/cell 75000).
- تمييع APC المشع لتركيز الخلية 5x10 5 / مل وإضافة 50μl (سيحتوي 2.5 × 10 4 خلايا) في كل جيدا مع التحفيز واضاف في السابق ، بما في ذلك الآبار وصفت بانها "Tregs فقط" ، "APC فقط" و "وسائل الاعلام فقط" في الجدول 1.
- إضافة 2.5 × 10 / 4 CD4CD25 جيدا أو خلايا تي في CD4CD25low triplicates التالية في تصميم الجدول 1.
- إضافة إلى المشاركة في Tregs الثقافات (B صف ، الجدول رقم 1) في نسبة 01:10 (خلايا Treg 2500) والآبار وصفت بانها "Tregs فقط" واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في ثاني أكسيد الكربون مع حاضنة 2 5 2 ٪ في الرطوبة المشبعة لمدة 72 ساعة.
- نبض الآبار مع 1μCi [3 H] ثيميدين وتستمر الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة المقبلة.
6. الحصاد والفرز
- حصاد الخلايا على لوحة متعددة الشاشات الحصاد باستخدام باكارد filtermate حصادة أو نظام بديل.
- إضافة التلألؤ السائل (Microscint 20) ، وغطاء لوحة الحصاد مع غطاء بلاستيكي شفاف تمهيدا للخطوة النهائية.
- قراءة التهم لكل دقيقة (CPM) / جيدا باستخدام NXT الأعلى الكونت (باكارد ، CT) أو نظام بديل.
7. نسبة الحوسبة القمع
- كما تم تربيتها في الخلايا triplicates ، يتم حساب المتوسط لكل حالة. إذا كان معامل الاختلاف هو> 30 ٪ ، ويتم التخلص من الاجتماع التحضيري للمؤتمر وناشز فقط من بئرين في المتوسط. يتم الحصول على نسبة مئوية من قمع الحوسبة [(SC) / ق] × 100 ٪ ، حيث s = نسخة في ثقافة واحدة وج = CPM في المشاركة في الثقافة.
- وساذجة (CD25) ، وتنشيط الجسم الحي (CD25low) هي مطلي الخلايا التائية وخلايا T المستجيب المستجيب ، هو القبض على الاختلاف في قدرة Tregs لقمع كل من هذه المجموعات الفرعية واستخدامها كمؤشر النذير الوظيفية المحتملة استنادا إلى فرضية يمكنهم أن الخلايا هي أصعب لقمع.
8. ممثل النتائج :
التباين الكبير في الأساليب المستخدمة والنتائج المستمدة من فحص في المختبر قمع الإنسان دفعتنا لإجراء دراسة شاملة للظروف المؤثرة في مقايسة 1. طورنا مقايسة ان الاختبارات ليس فقط وظيفة Treg ، ولكن أيضا نقائها ، بالنظر إلى النسبة المنخفضة بين Tregs : Teffs (1:10) ، والتي حددناها في وقت سابق من 6. بالإضافة إلى ذلك ، تختلف في ال TregsEIR القدرة على قمع بنجاح والسذاجة في خلايا الجسم الحي T - تفعيلها حتى في الاشخاص الاصحاء ، كما هو مبين في الشكل (3) وفي دراستنا السابقة 2،4 ، الذي يصبح أكثر بروزا في حالة خطر التوازن المناعي ، كما هو الحال في موضوعات في خطر لتطوير T1D . في مقايسة عملت بشكل جيد جدا في دراسة مقارنة أين نحن من وظيفة القمعية الطبيعية (nTregs) ، محرض (iTregs) ، وتوسعت في nTregs المختبر ، مما يسمح لنا للمقارنة بين وظيفتها مراقبة صحية ، والأخيرة ، ظهور (RO) ومنذ فترة طويلة T1D (LS ) T1D الموضوعات. استنتجنا أن الموضوعات T1D ريال عماني وكان أفضل القدرة على توليد والوظيفية على حد سواء iTregs nTregs توسعت مقارنة الموضوعات LS السيطرة T1D وصحية 7. وبالتالي ، يمكن استخدام هذا الاختبار أداة ممتازة في الاعتراف بالدولة على حد سواء المبكرة والمتأخرة من الخلل المناعي.
عرض مخطط تخطيطي 1 من الخطوات المتبعة في فحص في المختبر قمع
الشكل 1. خطوات للفحص في المختبر قمع قدم مع الصور
الشكل 2. استراتيجية المحاصرة في عزلة الخلية FACS. تم تعديل أ) عتبة + CD25 وفقا لملون تألقي ناقص واحد (FMO) ، ب) الخلايا وبوابات والسلبية FITC ، ج) FITC سلبية الخلايا وزيادة بوابات والتي جمعت في + CD CD25 ، CD25high + CD + CD25low وأقراص ( Tregs) تظهر مع النسب المئوية ، د) FACS فرز Tregs بعد الفرز ، ه) FACS فرز CD + CD25low بعد الفرز ، و) FACS CD4 + CD25 فرز - T الخلايا بعد الفرز
الشكل 3. نتائج الممثل من الموضوعات الصحية أ) نتائج ممثل التهم في الدقيقة (CPM) من الموضوعات الصحية المقدمة ، لأن الحضارات واحد لجميع خلايا فرعية المعنية (السذاجة - CD25 ، في الجسم الحي تفعيلها CD25low ، مستضد تقديم الخلايا وAPC T - Treg الخلايا التنظيمية) ، وكذلك شارك في ثقافات الخلايا التائية المستجيب (CD25 أو CD25low) وTregs. ب) النسبة المئوية لقمع كل CD25 ويرد CD25low المستجيب الخلايا التائية التي Tregs ذاتي لالضابطة الصحية (ن = 4). كما تم حساب قمع [(SC) / ق] × 100 ٪ ، حيث s = نسخة في ثقافة واحدة وج = CPM في الثقافة المشتركة. وقد لوحظ على الرغم من اختلاف طفيف في قدرة Tregs المستجيب لقمع الخلايا التائية ، لم يكن كبيرا (إقران اختبار t ع = 0.08). ج) من مقدمة والاجتماع التحضيري للمؤتمر في موضوعات المخاطر بالنسبة لكل ثقافة واحدة ، بما في ذلك وCD25 - CD25low والمستجيب الخلايا التائية وكذلك APC وTregs ، وشارك فيها ثقافات المصنف كل خلية T المستجيب فرعية مع النسبة المئوية (CD25-/Tregs وCD25low/Tregs). د) Tregs قمع كل CD25 - T والخلايا CD25low مستجيب بواسطة ذاتي ويرد في لTregs الموضوعات خطر (ن = 4). وكان الفرق في قدرة Tregs لقمع CD25 ، مقابل CD25low المستجيب الخلايا التائية كبيرة (إقران اختبار t ع = 0.04).
الجدول 1. مجموعة تتكون من التخطيطي في مقايسة قمع المختبر
| 1-3 | 4-6 | 7-9 | 10-12 | |
| A | CD4CD25 - | CD4CD25low | وسائل الاعلام فقط | وسائل الاعلام فقط |
| B | CD4CD25 - / Tregs | CD4CD25low / Tregs | Tregs فقط | APC فقط |
| C | ||||
| D | ||||
| E | ||||
| F | ||||
| G | ||||
| H |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والميزة الفريدة فقط لTregs ، يجب اختبار الوظيفة القمعية وموثوق بها بشكل موحد بين الموضوعات في مختلف مراحل تطور المرض داخل نفسه ، وبين الدراسات المختلفة. ونحن نقدم تفاصيل قمع مقايسة وضعت في مختبرنا ومساهمتنا في توحيد هذا الاختبار. في دراستنا التحسين واسعة ، ونحن مصممون ان تي تحفيز الخلية مع حبات CD3 المغلفة مكافحة الإنسان (UCHT1 استنساخ ، في تركيز 1μg/ml (مقابل 5μg/ml متوفرة تجاريا) في تركيبة مع PBMC كما APC توفير التحفيز الطبيعي قادرة على تفعيل جيدا كل مستجيب الخلايا التائية وTregs اختبار في المواد 1. اختيار الأضداد المضادة للCD3 الإنسان أمر ذو أهمية كبيرة ، كما هو الحال في أيدينا فقط أنسل الضد أعطت النتائج المتوقعة. التحفيز بالتزامن مع مكافحة CD3 الإنسان ومعاداة السامية وكان CD28 الإنسان ليست كافية لكشف الفروق بين الجماعات الموضوع (النتائج غير معروضة) ، في حين عرضت لوحة PBMC كاملة للمشاركين في تنشيطية الإشارات ، مما يزيد من فرصة لنقل الإشارة وتحفيز كفاءة.
ويمكن استخدام هذا البروتوكول مع كل leukopacks والدم للمريض. الفرق الوحيد هو كمية الدم التي يحتاج إلى تحميلها على الجزء العلوي من PLUS - Ficoll Paque في إجراء العزل PBMC. وسائل الإعلام المستخدمة في هذا الاختبار يحتوي على 10 ٪ مجمعة الإنسان AB مصل ، ونحن مصممون على أن تكون كبيرة ، بالإضافة إلى الفحص. ومع ذلك ، قبل استخدامها ، ومصل لابد من اختبار لقدرته على تنشيط PBMC من تلقاء نفسها PBMC البذور (في sixplicate وإضافة وسائل الاعلام RPMI كاملة مع المصل القديم ، مع عدم وجود المصل ومع المصل الجديد ، وبعد 72 ساعة من النبض لوحة ، واحتضان 16 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية ، والحصول على خلايا الحصاد قراءات CPM). الاجتماع التحضيري للمؤتمر زيادة PBMC مثقف مع المصل الجديد ليس نتيجة جيدة ويشير إلى وجود حاجة لمصل مع عدد كبير جديد.
لقد توصلنا إلى أن يتم الفرز يدويا MACS مع عمود LS جديدة لكل عينة كبيرة تعطي أفضل عائد من خلايا CD4 + T مقارنة Automax. بالإضافة إلى ذلك ، تقرر أن يكون النقاء Treg> 95 ٪ ، كما تقرره التعبير CD25 (الشكل 2D) ، وعدم الانتشار النووي في المختبر (الشكل 3A) ، وإمكانات عالية القمعية في مواضيع صحية في 1:10 النسبة بين Treg : المستجيبين ( الرقم 3AB) وأسمى تعبير Foxp3 فرعية معزولة بين الخلايا التائية (لا تظهر البيانات). يتم التخلص من الخلايا الملوثة وتفريغ FITC خلال FACS الفرز الداخلي في الخطوة التالية (2B الشكل). FACS تلون علامة CD4 ليست ضرورية ويمكن أن ينظر إلى هذه الفئة من السكان عن طريق خلية في مؤامرة FSC عندما يقترن مكافحة CD25 الإنسان ، ومع ذلك يمكن أن يتم ذلك. كما يتم فرز Tregs 1 ٪ أعلى من الخلايا معربا عن أكبر عدد من CD25 في جميع الفئات الموضوع. تطبيق هذا الإجراء الصارم لجميع المواد الدراسية بصرف النظر عن حالة المرض مكننا من استخدام واحد فقط والنسبة بين Tregs المستجيب الخلايا التائية (1:10) تخضع في جميع الفئات التي تم اختبارها. بالإضافة إلى ذلك ، وبنفس الشروط تعمل بشكل جيد بحيث شوهدت فرق في Treg المحتملة بين السذاجة والقمعية في خلايا الجسم الحي تي تنشيط تستخدم المستجيبين ، والتي ، على أساس الخلافات بينهما ، ويمكن توقع 1. ونحن مصممون أيضا أنه بعد فرز الخلايا FACS يجب أن تكون نسج أسفل قبل أن يتم إعداد مقايسة في القمع.
وقد تم قياس انتشار استخدام معالج بالتريتيوم ثيميدين. بدلا من ذلك ، يمكن قياس تكاثر الخلايا باستخدام 5 برومو 2' - deoxyuridine ، التناظرية بيريميدين ، والتي يتم تضمينها في الحمض النووي مركبة جديدة بدلا من ثيميدين. ويستند الكشف عن BrdU على تفكك اليوروبيوم ، وهي ملزمة لايون الأضداد الاعتراف BrdU (المضادة للBrdU والاتحاد الاوروبي) التي في إجراء الكشف إشارة يحصل فصل مضان الإفراج التي يمكن قياسها في مقياس التألق 8. وفقا للشركة المصنعة (DELFIA) هذا الاختبار هو حساسية مماثلة ل[3 H] ثيميدين. ويمكن أيضا تتبع انتشار الخلايا القيام به ، على سبيل المثال ، ومشتقاتها من الملح في tetrazolium MTT أو المقايسات XTT ATCC المتاحة من حيث العلاقة بين عدد الخلايا المنتجة وإشارة لابد أنشئت لأول مرة ، مما يسمح الطيفي الكمي للتغيرات في معدل الخلية الانتشار وقدرتها على البقاء. حتى الآن بديل آخر هو استخدام بقاء الخلية دي إتش إل ومقايسة الانتشار ، وعلى أساس تقدير أعداد fluorimetric الخلية الحية وقدرتها على البقاء. الخيار الآخر هو احتمال وصمة عار المستجيب خلايا تي فقط مع CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl استر) ورصد الحد من وصمة مع كل انقسام المقبل خلال فترة زراعة. ومع ذلك ، بالاعتماد على التحفيز المستخدمة في الفحص ، يمكن أن تعد الحضانة لأكثر من 48 ساعة يسبب قمم تمييزه من الخلايا CFSE إيجابية. وهكذا ، كل من لديه بعض المقايسات مزايا وعيوب ويجب أن يكون الأمثل لتحقيق النتائج المرجوة.
وتجرى دائما الألف ظهور لاختبار مكافحة الإنسان CD3 المغلفة علىPBMC ينبغي أن تكون صحية ولكن ليس قبل 5000 فوق 15000 من أجل حبات لاستخدامها في هذا النوع من الفحص. وضعناها عادة حبات مختلفة / نسبة الخلية عند اختبار كل دفعة من الخرز التي نتخذها ، وفي معظم الحالات لدينا نسخة في الدقيقة الأكثر اتساقا مع 3 حبات / 25000 الخلية مع خلايا / جيد. نكرر عادة طلاء إذا الألف ظهور أثناء اختبار الدفعة هي أقل 3000 ، حتى نصل 5،000-15،000 CPM / أيضا. وبالتالي ، فقد تم التحقق من عملية الطلاء على مستويات عدة ، ونحن نعتبر أنه يمكن الاعتماد عليها. ولذلك ، عندما يتم باستمرار من الألف ظهور مجموعة معينة من المواد (مثل صناعة السيارات في الأضداد إيجابية الموضوعات في خطر لتطوير T1D) أقل بالمقارنة مع الاشخاص الاصحاء ، لدينا سبب لاستنتاج قد يكون خطر أن عملية نقل الإشارة. ، على الرغم من أن العديد من الدراسات قد استخدمت خلايا ساذجة كما المستجيبين في قمع المقايسات التي نشرت حتى الآن 9-12 ، بعض ، على سبيل المثال ، استخدمت إما CD4 كما المستجيبين في ظروف مختلفة جدا مقايسة 13 أو PBMC كما المستجيبين ، في حضور وPBMC كما APC إقامتها في واحدة وثقافة مشتركة مع Tregs المضافة 14 أو 15 حيدات والمكثفات. حتى ولو سيتم إنشاء الألف ظهور في جميع الاختلافات حول مقايسة والاستنتاجات وستتاح للانتشار ، ونحن نعتقد أن وجود خلية فرعية أنقى موحدة كما المستجيبين يعطي نتائج أكثر تحديدا ، ويحمل إمكانات التوصل إلى استنتاجات إضافية حول كلا Tregs والمستجيبين. كما لدينا تجربة القمع المعروضة هنا تضم اثنين من مجموعات فرعية منفصلة الخلية نقية كما المستجيبين (CD4 + CD25 وCD4 + CD25low) ، فمن الممكن الحصول على معلومات قيمة حول توازن المناعة عند مقارنة النتائج من الاشخاص الاصحاء لالمتأثرة أو المعرضة للمخاطر على المواضيع وضع المرض الناتجة عن اضطراب في التوازن المناعي (مثل T1D). كما يتضح من عدد متزايد من الدراسات ، في تنشيط الخلايا الحية T (CD4 + CD25low) تظهر ضعف الحساسية لتأثير القمعية من Tregs 16-19. التفسير الدقيق لهذا السلوك يتطلب المزيد من التحقيق. بالإضافة إلى ذلك ، لقد أظهرنا وغيرها من الجهات التي Tregs في الموضوعات مع T1D لديهم خلل وظيفي 2،9،10 ، وهو صحيح أيضا بالنسبة لصناعة السيارات في الأضداد إيجابية الموضوعات ، في خطر لتطوير T1D ، كما بينا في الرقم 6 في تقريرنا الأخير 1. احد الاحتمالات هو أن جميع خلايا CD4 T في المواد المتضررة والمعرضة للخطر لتطوير T1D لديها عيب شائع في نقل الإشارة يمنعهم من الاستجابة بشكل كاف على التحفيز والتأثير على وظيفتها المستجيب. نتيجة لنقل الإشارة للخطر ، فإن المستجيب توليد خلايا T أقل في الدقيقة (هو مبين في الشكل 3C) وTregs لن قمع بكفاءة. هذه الاحتمالات وغيرها لا يزال يتعين مواصلة استكشافه. نظرا للعب دور كبير في Tregs الصحة والمرض ، وقياس العديد من المختبرات وظيفة ضبط Treg مقايسة لاحتياجاتهم وقدراتهم. وبالتالي ، يمكن أن عوامل كثيرة تختلف في مقايسة (المستجيب / Treg العزلة ، ونوع وعدد من الطبيعة ، والقوة المستجيبين من نوع ، والتحفيز ، وعدد من APC ، النسبة بين المستجيب / Tregs ، والوقت في الثقافة ، فضلا عن انتشار أسلوب الرصد ) ، مما يؤثر على وظيفة Treg. هذا العمل ، بالتالي ، لديها هدف لبدء عملية توحيد مقايسة السماح أسهل والمقارنة المباشرة لتقييم الدراسات المختلفة الدالة Treg.
في حال اعتماده ، سوف يسمح هذا البروتوكول للمقارنة وظيفة Treg بين المختبرات المختلفة للمواد الدراسية المتضررة مع أمراض المناعة الذاتية T1D وغيرها. هذا البروتوكول وتطبيق واسع النطاق ، ويمكن استخدامها لتقييم وظيفة Treg من أي موضوع ، بغض النظر عن المرض ، على الرغم من قيمته النذير يخص الأمراض التي هي فقط نتيجة لاضطراب في التوازن المناعي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة ماكجي ماكس المركز القومي للبحوث الطبية لكلية Diabetesat الأحداث ويسكونسن وطفولة معهد البحوث ويسكونسن. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها ، أو في الإعداد للمخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ficoll-Paque PLUS | Amersham | 17-1440-03 | |
| DPBS-1X | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypan Blue | Invitrogen | 15250-061 | |
| anti-CD4 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| Pre-separation filters | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| LS column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| Anti-human CD4-APCCy7 (clone RPA-T4) | BD Biosciences | 557852 | |
| Anti-human CD25-PE (clone M-A251; IL-2Rα) | BD Biosciences | 555432 | |
| Anti-human CD8-FITC (clone RPA-T8) | BD Biosciences | 555366 | |
| Anti-human CD14-FITC (clone M5E2; LPS receptor) | BD Biosciences | 555397 | |
| Anti-human CD32-FITC (clone FLI8.26; FcγR-type II) | BD Biosciences | 555448 | |
| Anti-human CD116-FITC (clone M5D12; GM-CSFRα chain) | BD Biosciences | 554532 | |
| Dynalbeads M-450 tosylactivated | Invitrogen | 140-13 | |
| Anti-human CD3 | Ancell | 144-024 | |
| Buffer1 | Home made | 0.1M Na2B4O7 pH7.6 | |
| Buffer2 | Home made | PBS/2mM EDTA/ 0.1% BSA pH7.4 | |
| Buffer3 | Home made | 0.2M Tris/0.1% BSA pH8.5 | |
| Complete RPMI media | Home made | RPMI 1640 media 2 mM L-glutamine 5 mM HEPES 100 U/μg/ml peni/strept 0.5 mM sodium pyruvate | |
| [3H] thymidine | PerkinElmer, Inc. | NET027Z005MC | |
| human pooled AB serum | Atlanta Biologicals | S40110 | |
| Multiscreen harvest plate | EMD Millipore | MAHFC1H60 | |
| Microscint 20 | PerkinElmer, Inc. | 6013621 |
References
- Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, 184-188 (2006).
- Nagaraja, T. N., Croxen, R. L., Panda, S., Knight, R. A., Keenan, K. A., Brown, S. L., Fenstermacher, J. D., Ewing, J. R. Application of arsenazo III in the preparation and characterization of an albumin-linked, gadolinium-based macromolecular magnetic resonance contrast agent. J. Neurosci. Methods. 157, 238-245 (2006).
- Supkowski, R. M., Horrocks, W. D. On the determination of the number of water molecules, q, coordinated to europium(III) ions in solution from luminescence decay lifetimes. Inorg. Chim. Acta. 340, 44-48 (2002).
- Menjoge, A. R., Kannan, R. M., Tomalia, D. A. Dendrimer-based drug and imaging conjugates: design considerations for nanomedical applications. Drug Discovery Today. 15, 171-185 (2010).
- Que, E. L., Chang, C. J. Responsive magnetic resonance imaging contrast agents as chemical sensors for metals in biology and medicine. Chem. Soc. Rev. 39, 51-60 (2010).
- Uppal, R., Caravan, P. Targeted probes for cardiovascular MR imaging. Future Med. Chem. 2, 451-470 (2010).
- Major, J. L., Meade, T. J. B. ioresponsive Bioresponsive, cell-penetrating, and multimeric MR contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 893-903 (2009).
- Datta, A., Raymond, K. N. Gd-hydroxypyridinone (HOPO)-based high-relaxivity magnetic resonance imaging (MRI) contrast agents. Acc. Chem. Res. 42, 938-947 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Lubag, A. J. M., Malloy, C. R., Martinez, G. V., Gillies, R. J., Sherry, A. D. Responsive MRI agents for sensing metabolism in vivo. Acc. Chem. Res. 42, 948-957 (2009).
- Castelli, D. D., Gianolio, E., Crich, S. G., Terreno, E., Aime, S. Metal containing nanosized systems for MR-molecular imaging applications. Coord. Chem. Rev. 252, 2424-2443 (2008).
- Caravan, P., Ellison, J. J., McMurry, T. J., Lauffer, R. B. Gadolinium(III) chelates as MRI contrast agents: structure, dynamics, and applications. Chem. Rev. 99, 2293-2352 (1999).
- Lauffer, R. B. Paramagnetic metal complexes as water proton relaxation agents for NMR imaging: theory and design. Chem. Rev. 87, 901-927 (1987).
- Yoo, B., Pagel, An overview of responsive MRI contrast agents for molecular imaging. Front. Biosci. 13, 1733-1752 (2008).
- Pandya, S., Yu, J., Parker, D. Engineering emissive europium and terbium complexes for molecular imaging and sensing. Dalton Trans. 23, 2757-2766 (2006).
- Nwe, K., Xu, H., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Ileva, L., Riffle, L., Wong, K. J., Brechbiel, M. W. A new approach in the preparation of dendrimer-based bifunctional diethylenetriaminepentaacetic acid MR contrast agent derivatives. Bioconjugate Chem. 20, 1412-1418 (2009).
- Nwe, K., Bernardo, M., Regino, C. A. S., Williams, M., Brechbiel, M. W. Comparison of MRI properties between derivatized DTPA and DOTA gadolinium-dendrimer conjugates. Bioorg. Med. Chem. 18, 5925-5931 (2010).
- Caravan, P., Das, B., Deng, Q., Dumas, S., Jacques, V., Koerner, S. K., Kolodziej, A., Looby, R. J., Sun, W. -C., Zhang, Z. A lysine walk to high relaxivity collagen-targeted MRI contrast agents. Chem. Commun. , 430-432 (2009).
- Leôn-Rodríguez, L. M. D., Kovacs, Z. The synthesis and chelation chemistry of DOTA-peptide conjugates. Bioconjugate Chem. 19, 391-402 (2008).
- Boswell, C. A., Eck, P. K., Regino, C. A. S., Bernardo, M., Wong, K. J., Milenic, D. E., Choyke, P. L., Brechbiel, M. W. Synthesis, characterization, and biological evaluation of integrin αVβ3-targeted PAMAM dendrimers. Mol. Pharm. 5, 527-539 (2008).
