방법을 개별적으로 선택 조작 설명 및 이미지 라이브 병원균은 회전 디스크 현미경을 결합 광학 트랩을 사용하고 있습니다. 광학 트랩은 생물의 공간적 시간적 및 제어를 제공하며, 호스트 세포에 인접 장소. 형광 현미경은 세포에 최소한의 섭동와 역동적인 세포 상호 작용을 캡처합니다.
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이 논문에서
요약
초록
동적 라이브 셀 이미징은 면역 체계 1, 2 셀 사이의 실시간 상호 작용의 직접적인 시각화를 허용하지만, phagocytic 세포와 미생물 사이의 공간 및 시간적 통제의 부족은 병원균에 호스트 응답의 초기 상호 작용에 관찰 초점을 맞추고 렌더링이 어려운. 역사적으로, 이러한 phagocytosis 3와 같은 세포 연락처 이벤트는 두 세포 유형을 혼합하여 몇 군데있다, 그리고 지속적으로 상호 작용의 적절한 단계에서 serendipitous 세포 연락처를 찾을 수있는 필드의 전망을 검사합니다. 이러한 이벤트의 확률적 특성은 지루한이 프로세스를 렌더링하고,이 접근법에 의해 세포 - 세포 접촉 초기 또는 덧없는 이벤트를 관찰하기가 어렵습니다. 이 방법은 접촉의 가장자리에있는 셀 쌍을 발견하고, 그들은 완전의 연락처까지 그들을 관찰 필요하거나하지 않습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 문화의 세포를 위치로 비침습, 비 - 파괴적인, 그러나 신속하고 효과적인 방법으로 광학 트래핑을 사용합니다.
광학 트랩, 혹은 광학 핀셋은 점점 삼차원 4 셀 및 기타 마이크론 크기의 입자를 캡처하고 육체적으로 조작하는 생물 학적 연구에 활용하고 있습니다. 방사선 압력 먼저 관찰 1970 년 5, 6의 광학 트위터 시스템에 적용하고, 첫번째 1987 7 생물 학적 표본을 제어하는 데 사용였습니다. 이후, 광학 핀셋은 생물학적인 현상 8-13 다양한 탐사하는 기술로 성숙했습니다.
우리는 진보로 결정 호스트 세포와 상호 작용을 촉진하는 생리적 환경에서 병원성 생물의 아름다운 공간과 시간적 제어를 제공하기 위해 온도 및 습도 제어 디스크 공촛점 현미경을 회전과 함께 광학 트랩을 통합하여 세포 이미징을 살고 방법 14 설명 연산자. 라이브, immunocompromised 개인 15, 16 (예 : AIDS, 화학 요법 및 장기 이식 환자)에서 잠재적으로 치명적인, 침략 감염을 일으킬 수 캔디다 albicans와 Aspergillus fumigatus, 같은 병원성 미생물은 광학에 인접한 비파괴 레이저 농도를 사용하여 갇혀 이동되었습니다 병원체를 phagocytose 수 macrophages. 고해상도는 빛과 형광 기반의 동영상을 전송 살아있는 세포의 phagocytosis의 초기 이벤트를 관찰할 수있는 능력을 만들었습니다. 면역학의 광범위한 적용을 설명하기 위해, 기본 T - 세포는 또한 갇혀 있단에 반대 인 경우에는 3 번 CD에 들어 코팅 microspheres와 시냅스를 형성 조작 및 버렸네 형성의 시간 저속 영상도 얻은되었습니다. 면역 세포에 관하여 사는 병원균의 훌륭한 공간적 제어를 발휘하는 방법을 제공함으로써, 세포의 상호 작용은 세포에 최소한의 섭동과 형광 현미경에 의해 캡처 수 있으며, 타고난과 적응 면역 반응의 초기에 강력한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
프로토콜
1. 광학 트래핑에 대한 병원균의 문화 조건
- 3 일간 30 SBD (Sabouraud 덱스 트로 오스)이있는 세미 솔리드 한천 미디어 ° C에서 A. fumigatus (B-5233/RGD12-8)을 성장.
- C. 그로 30 흔드는 인큐베이터에 하루 100 μg / ML 암피실린를 포함하는 YPD에 albicans (SC5314) (효모 - 펩톤 덱스 트로 오스) 액체 문화 ° C.
2. 형광 라벨에 대한 병원균의 준비
- 수확은 병원균의 양을 원하는과 1.5 ML 반응 관에 전송할 수 있습니다.
- 인산염의 추가 300 μL 반응 관에 호수 (PBS)를 버퍼.
- 30 초 동안 혼합 Sonicate.
- 1 분 4,000 rpm으로 원심 분리기.
- 펠렛은 그대로두고, 뜨는을 대기음.
- 반복 (2.4)과 (2.5) 두 번 더.
- PBS의 500μL에 Resuspend.
3. 형광 염색과 병원균의 라벨링
- 100 μL dimethylformamide (DMF) (....
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토론
5 μm의 -이 작품에서 우리는 3 μm의 사이의 크기와 병원균을 캡처하는 광학 트랩을 사용합니다. 저희 연구실에 관심이 병원균은 일반적으로 이러한 차원을 가지고 있지만, 여기에 설명된 광학 트위터 시스템은 크기의 큰 범위를 함정에 융통성이 있습니다. 사실 광학 트랩은 단일 원자의 직경 약 10 μm의 세포에 이르기까지 입자를 캡처하는 데 사용되었습니다. 원형, 타원형, 그리고 생물 학적 병원균과 함께 작업할 때 유용합니다 매우 길쭉한 입자 : 또한,이 광학 트래핑 시스템은 다양한 형태의 입자를 포착 수있었습니다.
이 방법, phagocytosis와 버렸네 형성과 함께, 실시간으로 조사되었고, 세포 표면에 구조적 변화 분석했다. 셀 옆에 위치 입자에 의해, 살아있는 병원균은 제어 및 phagocytic 기계를 활성화하고 살아있는 세포의 면역 반응을 연구하고 phagocytosis의 전체 과정을 통해 이벤트의 절대 시작을 모니터하고 조작했다. 그 결과, phagocytic .......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 의학 내부 자금의 매사 추세츠 종합 병원과 (JMT, MKM, MLC, JMV), 바이오 메디컬 이미징 국립 연구소 생물 부여 T32EB006348 (CEC), 매사 추세츠 종합 병원의 전산과 통합 생물학 발전 기금을위한 센터 및 AI062773 (지원했습니다 RJH), 보조금 AI062773, DK83756, 그리고 DK 043,351 (RJX), NSF 0,643,745 (MJL), NIH R21CA133576 (MJL), 미 국립 보건원의 알레르기 및 전염병 국립 연구소 (NIAID) (NIH) AI057999 (JMV ). 우리는 기술 지원을하는 데 도움이 토론을 위해 니콜라스 C. 요더 감사하고, 찰스 펠츠 (RPI 주식 회사).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 (옵션) |
| A. fumigatus | 알비노 변형, B-5233/RGD12-8, KJ 권 - 정, NIH에서 선물 | ||
| C. albicans | SSY50 - B 돌연변이, 엘레 프 테 리오스 Mylonakis, MGH에서 선물, SC5314 변형, 제랄드 핑크의 선물, 화이트 헤드 연구소 | ||
| 알렉사 플루어 488 | Invitrogen | A20000 | |
| 알렉사 플루어 647 | Invitrogen | A20006 | |
| dimethylformamide | 시그마 | D4551 | |
| 신선한 혈액 | RJW 히스, MGH, HMS의 선물 | ||
| 니콘 거꾸로 현미경 | 니콘 | 모델 티 - E | |
| 트래핑 레이저, ChromaLase | 블루 스카이 연구 | 클라스 - 106 - STF02 - 02 | |
| 형광 여기 레이저 | 응집 성의 | 모델 이노바 70C | |
| 트래핑 구성 요소에 대한 Breadboards | Thorlabs | MB1224, MB1218 | |
| 광학 공기 테이블 | 기술 매뉴펙쳐링 코퍼레이션 | ||
| 페달 제어 전자 셔터 | Uniblitz | 빈센트 어소, 로체스터, NY에서 구입한 | |
| Singlemode 광섬유 | 오즈 광학 | PMJ - 3S3S - 1064-6 | |
| 섬유 포지셔너 | Thorlabs | PAF - X - 5 - C | |
| 섬유 콜리 메 이터 | 오즈 광학 | HPUCO - 23-1064 - P - 25AC | |
| 망원경에 대한 렌즈 | Thorlabs | AC254 - 150 - B | 150mm의 초점 거리 |
| 번역 단계 (X, Y, Z) | 뉴 포트 | M - 461 - XYZ | |
| IR 이색성 거울 | 채도 | ET750 - SP - 2p8 | |
| 목표 렌즈 (100X) | 니콘 | NA = 1.49, 기름 침지, TIRF 목표 | |
| 공촛점 머리 | 요코 | CSU - XI | |
| 편광판 | 니콘 | MEN51941 | |
| 월라스튼 프리즘 | 니콘 | MBH76190 | |
| EM - CCD 카메라 | 하마 마츠 | C9100 - 13 | |
| CCD 카메라 (오르카 ER) | 하마 마츠 | C4742 - 80 - 12AG | |
| 필터 휠 | Ludl | 99A353 | |
| 필터 휠 | 서터 | LB10 - NWE | |
| Chambered coverglass | Lab-Tek/Nunc | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111 - 51D | 안티 인 경우에는 3 번 CD와 코팅 |
| Dulbecco의 수정된 이글 배지 (DMEM) | Invitrogen / Gibco | 10,313 | |
| 페니실린 / 스트렙토 마이신 | Invitrogen / Gibco | 15140-122 | |
| L - 글루타민 | Invitrogen / Gibco | 25030-081 | |
| 태아 소 혈청 (HyClone) | ThermoScientific | SH30071.03 |
참고문헌
- Grakoui, A. The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Monks, C. R. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
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재인쇄 및 허가
