本文中，我们描述了用于研究趋化性的详细活细胞成像方法。我们介绍了荧光显微镜技术，用于监测迁移细胞中信号事件的时空动态。对信号事件的测量使我们能够进一步理解GPCR信号网络如何实现对趋化因子梯度的感知，并调控真核细胞的定向迁移。
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方法文章
成像介导趋化性信号事件的G蛋白偶联受体（GPCR）：以盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）为例
本文内容
摘要
摘要
许多真核细胞能够感知其环境中化学信号的浓度梯度，并随之定向迁移 1这种由化学信号引导的细胞迁移被称为趋化性，对于多种细胞执行其功能至关重要，例如免疫细胞的迁移和神经元细胞的模式形成。 2, 3一大类G蛋白偶联受体（GPCRs）可识别多种小分子肽（称为趋化因子），从而调控细胞迁移 体内 4趋化性研究的最终目标是阐明GPCR机制如何感知趋化因子梯度，并调控引发细胞趋化的信号事件。为此，我们采用成像技术实时监测趋化剂在时空上的浓度分布、细胞在趋化剂梯度中的运动行为、GPCR介导的异源三聚体G蛋白的活化，以及真核细胞趋化过程中涉及的细胞内信号事件 5-8简单的真核生物， 盘基网柄菌表现出与白细胞相似的趋化行为， D. discoideum 是研究真核生物趋化性的关键模式系统。作为自由生活的变形虫， D. discoideum 细胞在营养丰富的培养基中分裂。当处于饥饿状态时，细胞进入发育程序，通过cAMP介导的趋化作用聚集，形成多细胞结构。许多参与cAMP趋化的组分已被鉴定出来 D. discoideumcAMP 与 GPCR（cAR1）结合后，可诱导异源三聚体 G 蛋白解离为 Gα 和 Gβγ 亚基 7, 9, 10Gβγ亚基激活Ras，后者进而激活PI3K，将PIP2 进入 PIP3 在细胞膜上 11-13磷酸肌醇磷酸酯3 作为含有pleckstrin同源（PH）结构域蛋白的结合位点，从而将这些蛋白招募至细胞膜 14, 15cAR1受体的激活还调控PTEN与细胞膜的结合，PTEN可使PIP去磷酸化3 至 PIP2 16, 17分子机制在人中性粒细胞等细胞由趋化因子GPCR介导的趋化作用中具有进化保守性 18我们介绍了以下用于研究趋化性的方法 D. discoideum 细胞1. 化学趋化组分细胞的制备 2. 在cAMP梯度中对细胞趋化作用进行成像 3. 在单个活细胞中监测GPCR诱导的异源三聚体G蛋白活化 4. 成像化学引诱剂触发的动态PIP3 实时监测单个活细胞的反应。我们开发的成像方法可用于研究人类白细胞的趋化性。
方案
1. 嗜中性粒细胞样细胞Dictyostelium discoideum的感受态细胞制备
- 为了获得对趋化因子cAMP具有趋化性的D. discoideum细胞，从22°C振荡培养的D3-T富集培养基中收获正在生长的细胞。
- 用无营养发育缓冲液（DB缓冲液，含5 mM Na2HPO4、5 mM KH2PO4、2 mM MgCl2和0.1 mM CaCl2）将细胞洗涤两次。
- 将细胞重悬于DB缓冲液中，密度为2×107个细胞/ml。
- 将10 ml细胞悬液置于250 ml锥形瓶中，在22°C、100 rpm条件下振荡培养1小时。
- 在6小时内每隔6分钟向10 ml细胞悬液中加入100 μl的7.5 μM cAMP储备液，使最终cAMP浓度达到75 nM，此过程称为cAMP脉冲处理。经过5–6小时的cAMP脉冲处理后，D. discoideum细胞即具备对cAMP浓度梯度的趋化能力。
- 以200 g离心5分钟收集细胞，然后用含有2.5 mM咖啡因的DB缓冲液重悬细胞，并在22°C、200 rpm条件下振荡培养20分钟，使细胞处于趋化反应的准备状态。
2. 在可见且可操控的趋化因子梯度中....
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讨论
细胞达到趋化感受态阶段的过程
对于野生型 D. discoideum 细胞，在室温下通过约 5 ˜ 6 小时的 cAMP 脉冲诱导，可使其进入具有良好趋化能力的阶段，此阶段的细胞表现出明显的极性形态和快速的细胞迁移（图 1）。多个因素，如脉冲所用的 cAMP 浓度、温度以及不同的遗传背景，均可能影响细胞达到趋化能力阶段的过程。cAMP 梯度引导细胞向 cAMP 源方向移动，这种定向的细胞迁移被称为趋化性。然而，由于发育不足或遗传背景原因未能达到趋化能力阶段的细胞，可能不会表现出两个典型特征：极性形态和快速移动能力。另一方面，因过度发育而超过趋化能力阶段的细胞常常聚集成团，难以分离为单个细胞用于成像实验。
1. 在可见且可操控的趋化因子梯度中对趋化细胞进行成像
将荧光标记且可操控的趋化因子刺激应用于实验系统是一项技术进步。传统上，我们采用均一施加的刺激（也称为均匀刺激）或梯度刺激来观察细胞形态和行为。然而，这种“盲式”刺激无法提供刺激物到达细胞的时间-空间信息，因此.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家过敏与传染病研究所（NIAID）的院内基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| D3-T 培养基 | KD Medical | ||
| 咖啡因 | Sigma-Aldrich | ||
| Latrunculin B | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Alexa 594 | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| cAMP | Sigma-Aldrich | ||
| ChronTrol XT 可编程定时器 | ChronTrol Corp | ||
| Miniplus 3 蠕动泵 | Gilbson | ||
| 平台式旋转摇床 | |||
| FemtoJet 微毛细管压力供给系统 | Eppendorf | ||
| 单孔和四孔 Lab-Tek II 玻片培养室 | Nalge Nunc international | ||
| LSM 510 META 或同等荧光显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | 配备 40X 1.3 NA 或 60X 1.4 NA 油镜 DIC Plan-Neofluar 物镜 | |
| Olympus X81 或同等设备 | Olympus Corporation | 需配备 100X 1.47 NA TIRF 物镜 |
参考文献
- Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. Temporal and spatial regulation of chemotaxis. Dev Cell. 3, 469-469 (2002).
- Murphy, P. M. The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors. Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).
- Devreotes, P. N.
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