Это видео содержит подробный протокол для изучения фармакологического профиля человека TRPA1 каналов с использованием FlexStation 3. Протокол охватывает детали клеточного подготовки, краситель загрузки и эксплуатации микропланшетов читателя, FlexStation 3.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Клеточная Кальций Пробирной для средних и высокопроизводительного скрининга из ГТО Функции канала с помощью FlexStation 3
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
FlexStation Molecular Devices '3 представляет собой настольный многорежимный планшет ридер, способный автоматизированного измерения флуоресценции в мульти-луночных планшетах. Он идеально подходит для средней и высокой пропускной способностью экраны в академических условиях. Она имеет интегрированный модуль передачи жидкости оснащены многоканальным pipetter и машина читает одну колонку в то время, контролировать изменения флуоресценции различных флуоресцентных реагентов. Например, FlexStation 3 был использован для изучения функции Са 2 +-проницаемые ионные каналы и G-белком рецепторы, измеряя изменения внутриклеточного свободного Са 2 + уровня. Переходный рецепторный потенциал (ГТО) каналы большое семейство неселективных каналов катионов, которые играют важную роль во многих физиологических и патофизиологических функций. Большинство каналов ГТО являются кальций проницаемыми и вызывают приток кальция после активации. В этом видео, мы демонстрируем применение FlexStation 3 до исследования фармакологических профиля TRPA1 канал, молекулярный сенсор для многочисленных вредных раздражителей. НЕК293 временно или стабильно выражения человеческих TRPA1 каналов, вырос в 96-луночных планшетах, которые загружаются с Са 2 +-чувствительного флуоресцентного красителя, Fluo-4, и в реальном времени флуоресценции изменения в этих клетках измеряются до и во время применения TRPA1 агонист используя режим FLEX из FlexStation 3. Влияние предполагаемых TRPA1 антагонист был также рассмотрен. Данные передаются из программного обеспечения SoftMax Pro построить концентрация-ответ отношения TRPA1 активаторов и ингибиторов.
Протокол
1. Сотовые препаратов в 96-луночных
Для НЕК293 временно trasfected с человеческими TRPA1 кДНК
- HEK293 клетки выращивают в течение одного-двух дней в минимальной необходимой среде Дульбекко (DMEM), содержащих 4,5 мг / мл глюкозы (Thermo Scientific, SH3002201), с добавлением 10% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (Invitrogen, 16000-044), 50 единиц / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина (Invitrogen, 15140-163). В день трансфекции, плотность клеток должна достигнуть 70-90%.
- Шерсть 96-луночных планшетах с помощью пипетки 50 мкл поли-L-орнитин (Sigma P3655, 20 мкг / мл в стерильной дистилли....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Внутриклеточного Са 2 + играет важную роль во многих физиологических и патологических состояний, таких как нейромедиатор релиз (3), сердечной потенциала действия (4), сокращение мышечных клеток (5), сотовые передачи сигнала (6-7), и excitotoxic клеточной смерти ( 8). Измерение внутриклеточного Са 2 + уровня помогает выяснить функциональные изменения Са 2 +-проницаемые каналы в мембране плазмы или внутриклеточных органелл и вклад
Са 2 + в вышеуказанных процессах (9-13). .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Мы благодарим доктора. Джон Хэнкок, Рэй Гриль, Эндрю Моррис и Ольга Чумакова за их поддержку. FlexStation 3 система является частью UTHSC Cytodynamic фонда Imaging. Мы также благодарим д-ра. Ardem Patapoutian и Майкл Bandell из исследовательского института Скриппса и геномики Института Новартис Фонд исследований (GNF) для обеспечения HEK293-hTRPA1 стабильной клеточной линии. Исследование частично поддержана грантами NIH (GM081658 для MXZ) и Техасского медицинского центра болезней пищеварительного тракта центр (к HH) и Миссия Connect / TIRR Foundation (для домохозяйств).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии (необязательно) |
| FlexStation 3 | Molecular Devices | ПК3 | |
| 96-Ну, Советы FlexStation Пипетируйте | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| 96-луночных | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 96-Ну Открытый плоские пластины Нижний | Costar | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo-4 утра | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Поли-L-орнитин | Сигма | P36551 | |
| пробенецид | Сигма | P8761 | |
| Бычий сывороточный альбумин | Сигма | A9418 |
Ссылки
- Hu, H. Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).
- Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels. Nat Chem Biol. 5, 183-19....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
