Summary
Protocol
NIH3T3-Zellen der Zubereitung:
A. Zellen für Ejection
- Trypsinize Zellen, dann verdünnt 1:1 mit Zell-Medien und Übertragung von einem T75 Kolben in ein 15 ml Falcon-Röhrchen
- Spin down-Zellen zu einem Pellet durch Zentrifugation, Absaugen des Überstandes und waschen Sie die Zellen mit DPBS
- Spin down-Zellen zu einem Pellet erneut, und saugen Überstand
- Die Zellen in den Medien
- Bestimmen Sie die Zelldichte mit Zählkammer (~ 200 X 10 4 Zellen / ml pro Flasche T75)
- Zentrifugenzelle Lösung absaugen Überstand und resuspendieren in entsprechender Höhe von Medien für unterschiedliche Zell-Konzentrationen
B. Zell-Ausstoß
- Vortex-Zellen, bevor Sie zum Auswerfen
- Transfer-200 ul der Zell-Lösung in die Spritze
- Festlegen geeigneter Modus Impulsgeber
- Zum Auswerfen einzelner Tropfen und mehrere Tröpfchen (Bursts), setzen Impulsgeber zu "E. BUR"-Modus
- Für die kontinuierliche Tröpfchenausstoß setzen Impulsgeber auf "NORM"-Modus
- Ändern Signal-Einstellungen
- Set hohen und niedrigen Ausgangsspannung: HIL bis 5 V und LOL auf 0 V und sicherstellen, dass die "LIM" LED ist an
- Set-Signal als Rechteckimpuls
- Ändern Sie die Höhe der Zeit das Magnetventil ist offen für Tröpfchenausstoß indem Sie den Wert für "WID" oder Ändern Einschaltdauer ("Pflicht")
- Ändern Sie die Frequenz eines Rückschlags indem Sie den Wert für "PRO"
- Ändern Sie die Anzahl der Tropfen in einem Ausbruch, indem der Wert für "BUR" ausgeworfen
- Eject Zelle Lösung auf den vorbereiteten Untergrund für die Bildgebung mit Mikroskop
C. Färbung
- Make up Farbstofflösung mit 0,5 ul Calcein-AM und 2 ul Ethidium Homodimer pro ml DPBS
- Tauchen vorbereiteten Untergrund in Farbstofflösung
- Lassen Sie Probe für 10 Minuten bei 37 ° C inkubieren, bevor Bildgebung
Experiment Validation
- Auf einem Nikon Eclipse TE-2000 U Fluoreszenzmikroskop
- Spot fortschrittliche Software (Diagnostics, Inc.)
- Live / Dead Assay
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Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Fluorescent Microscope | Nikon Instruments | Eclipse TE-2000 U | ||
Solenoid valve cell ejector | Operation frequency: 1 KHz, 30psi, 50nl~0.5ul. 12V Valve Driver: 2.5 Amp drive current | |||
5-Gallon Portable air tank | Coleman | Powermate CT5 | Pressurized air: 30 PSI | |
Pressure regulators | Marsh Bellofram | |||
Pulse Generator | HP8112A | Actuation frequency generation: 50 MHz | ||
XYZ-stage | Newmark Systems | With Stepping motor: 6inch travel xy-stage(NLS4-6-25), 2.5inch travel z-stage(NLS4-2.5-25), 3axis controller(NSC-G3), 0.1um resolution | ||
NIH 3T3 | Cell-line | fibroblasts | ||
Trypsin | 0.05% solution | |||
NIH 3T3 cell medium | ||||
DPBS | Buffer | |||
T75 | Tissue culture flasks | |||
Plastic conical tubes | 15 ml, for tissue culture |