Summary
ووصف طريقة لphotoactivate الخلايا واحدة تحتوي على البروتين في قفص الفلورسنت باستخدام اثنين من الفوتون امتصاص من تي: الياقوت مذبذب يزر الفيمتو ثانية. إلى خريطة مصير الخلية photoactivated، يتم استخدام المناعية. ويمكن تطبيق هذه التقنية إلى أي نوع من الخلايا.
Abstract
القدرة لتسمية تفاضلي الخلايا واحدة لديه آثار هامة في علم الأحياء التنموية. على سبيل المثال، تحديد كيفية المكونة للدم، الأنساب سفينة اللمفاوي، والدم تنشأ في النامية الأجنة يتطلب رسم الخرائط مصير وسلالته البحث عن المفقودين من الخلايا السلائف غير متمايزة. في الآونة الأخيرة، والبروتينات photoactivatable والتي تشمل: لقد تلقت إيوس 1، 2، PAmCherry 3، Kaede الذي 4-7، pKindling 8، وKikGR 9 و 10 الفائدة واسعة كما تحقيقات الخلية البحث عن المفقودين. يمكن أن تتحقق الطيف مضان من هذه البروتينات للضوء تحويلها بسهولة مع الإثارة UV، مما يسمح للإلى يمكن تمييزها يبلغ عدد سكانها من الخلايا من تلك التي المتاخمة لها. ومع ذلك، يجوز للphotoefficiency من البروتين المفعلين يمكنهم تحد من طويلة الأجل الخلية تتبع 11. كبديل للالبروتينات photoactivatable، في قفص وقد تم فلوريسئين-ديكستران المستخدمة على نطاق واسع في نظم نموذجية لالجنين 7، 12-14. تقليديا، إلى uncage فلوريسئين-ديكستران، UV كسكيتوقد استخدم أوجه من منزل مصباح مضان أو أ UV الفوتون ليزر واحدة؛ ومع ذلك، مصادر مثل هذه تحد من القرار المكاني للتنشيط ضوئي. هنا ونحن يقدم تقريرا على بروتوكول إلى خريطة مصير، التتبع سلالته، وكشف عن واحدة الخلايا المسمى. يتم photoactivated الخلايا واحد في الأجنة حقن مع في قفص فلوريسئين-ديكستران مع البقول ليزر بالقرب من-الأشعة تحت الحمراء المنتجة من أ الفيمتو ثانية التيتانيوم ليزر الياقوت. هذا الليزر هو العرفي في جميع المجاهر اثنين من الفوتون مبائر مثل المجهر 510 LSM NLO META المستخدمة في هذا الورق. منذ الأنسجة البيولوجية يكون شفافا بالنسبة بالقرب من-الأشعة تحت الحمراء التشعيع 15 يمكن أن، أن يركز عليها البقول ليزر عميقة داخل الجنين دون uncaging الخلايا أعلاه، أو أدناه الطائرة التنسيق المحددة. ولذلك، يتم التي يسببها غير الخطية اثنين من الفوتون امتصاص فقط عند بؤرة هندسية إلى uncage فلوريسئين-ديكستران في خلية واحدة. للكشف عن والخلية التي تحتوي uncaged فلوريسئين-ديكستران، ونحن تصف على بروتوكول الكيمياء الهيستولوجية المناعية بسيطة 16 إلى visua بسرعةليز الخلية المنشط. للبروتوكول التنشيط وكشف عن المعروضة في هذا الورقة هو متعددة الاستعمالات ويمكن تطبيقها على أي نظام نموذج.
ملاحظة ما يلي: ويمكن الاطلاع على الكواشف المستخدمة في هذا بروتوكول في بموجب الجدول المرافق في نهاية من هذه المادة.
Protocol
1. التوليف من في قفص فلوريسئين-ديكستران (مقتبس من الرقم المرجعي. 14)
- إعداد التوصل إلى حل M 0.1 من الصوديوم بورات مخففة في DDH 2 O.
- قياس 4 ملغ من aminodextran كيلو دالتون 10 و إضافته إلى أنبوب فلوريسئين CMNB-في قفص.
- إضافة 500 ميكرولتر من الحل الصوديوم بورات محضرة (الخطوة 1.1) إلى أنبوب فلوريسئين CMNB-في قفص. تتويج الأنبوب ودوامة لمدة 30 ثانية ليتم حل مجلس الخليط.
- تسمح للالخليط إلى رد فعل بين عشية وضحاها على nutator في درجة حرارة الغرفة. تغطية أنبوب مع احباط المعدن، الى منع التعرض من هذا المزيج على إحساس للضوء المحيط.
- الحصول على زيادة ونقصان desalt زيبا العمود وتويست قبالة كاب القاع. وضع علامة على دوت على العمود، والتي سوف أن تستخدم لأورينت العمود عندما الطرد المركزي. ضع عمود في وأنبوب 15 مل فالكون مخروطي الشكل. ملاحظة ما يلي: والحل في العمود زيادة ونقصان هو المخزن المؤقت العمود.
- ترخي الحد الأقصى للالأعلى على العمود زيادة ونقصان desalt. ضع ال 15 مل أنبوب فالكون مخروطي الشكل التي houses العمود زيادة ونقصان desalt في أ CENTRifuge. أورينت العمود زيادة ونقصان مع دوت وضع علامة (الخطوة 1.4) التي تواجه مركز من الدوار أجهزة الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي لأنبوب في 1000 XG لمدة 2 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- بعد الطرد المركزي، قم بإزالة العمود زيادة ونقصان desalt من الأنبوب فالكون. تجاهل على حد سواء تدفق يتم جمعها من خلال والأنبوب 15 مليلتر مخروطي الشكل. الحصول على جديدة 15 مل أنبوب فالكون مخروطي الشكل، ثم ضع العمود زيادة ونقصان desalt في أنبوب فالكون جديدة. ملاحظة ما يلي: وبعد الطرد المركزي، يجب أن تظهر ضغط السرير الراتنج العمود. استخدام العمود على الفور.
- يجب الحصول على خليط كان رد فعل (في قفص فلوريسئين-ديكستران) في الخطوة 1.3. إزالة الحد الأقصى للمن العمود زيادة ونقصان ونضح الخليط كان رد فعل وتطبيق ذلك ببطء إلى وسط من العمود زيادة ونقصان desalt. بعد تطبيق الخليط كان رد فعل، يستعاض عن الحد الأقصى المفروض على العمود زيادة ونقصان.
- ضع أنبوب فالكون التي houses العمود زيادة ونقصان desalt في جهاز للطرد المركزي. القيام به كما في الخطوة 1.5، أورينت العمود زيادة ونقصان مع دوت ملحوظ التي تواجه مركز من الدوار أجهزة الطرد المركزي. Centrifugه الأنبوب في 1000 XG لمدة 2 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- بعد الطرد المركزي، سيتم التي تم جمعها على خليط الأصفر (في قفص فلوريسئين-ديكستران) (ما يقرب من 400 ميكرولتر) في أنبوب 15 فالكون مل. نقل في قفص فلوريسئين-ديكستران خليط إلى أحد أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
- تغطية على الفور الأنبوب مع احباط المعدن، الى منع التعرض من هذا المزيج على إحساس للضوء المحيط. يجفد على في قفص فلوريسئين-ديكستران الخليط في أ speedvac. وينبغي أن تجفيد من 350 ميكرولتر اتخاذ ما يقرب من 4 ساعات.
- بعد تجفيد كاملة، إعادة تعليق كان المسحوق، (حوالي 3 ملغ) في DDH 2 O إلى أحد تركيز النهائي من ما يقرب من 1٪ ث / V. خلط من قبل vortexing لفترة وجيزة لتعليق كان المسحوق،.
- قسامة على في قفص فلوريسئين-ديكستران حيز منفصلة أنابيب احباط معدنية المشمولة، وتخزين لهم في -20 ° C.
2. حصاد من الأجنة وحقن مكروي من في قفص فلوريسئين-ديكستران
* يستخدم هذا الإجراء الزردكما هذا الحيوان النظام النموذجي.
- على في اليوم السابق الحقن، قم بتعيين ما يصل الصلبان الزرد إما 01:01 الذكور-إلى-الإناث أو 2:01 الذكور-إلى-الإناث في تربية الدبابات مع المقسمات.
- في صباح اليوم التالي تغيير المياه خزان تربية وإزالة المقسمات. إعداد على الفور على بعد 5 1/10 المخفف ميكرولتر حل العاملة التابعة في قفص فلوريسئين-ديكستران في إما 1 وسائل الاعلام Danieau X (انظر إعداد من حلول) أو DDH O. 2 تغطية أنبوب حل العمل مع احباط المعدن، الى منع التعرض للضوء.
- ماصة على محضرة في قفص فلوريسئين-ديكستران حل (الخطوة 2.2) حيز الإبرة. قبل قطع غيض إبرة إلى الحجم المناسب تحت المجهر تشريح، ضع قطعة من عامل التصفية الأصفر شفافة في الجبهة من المصدر ان الضوء الأبيض. سوف عامل التصفية الأصفر منع uncaging عفوية من فلوريسئين-ديكستران خلال عن طريق الحقن. عندما تبحث من خلال قطعة العين بصري، ينبغي للمصدر الضوء تظهر الصفراء.
- جمع الأجنة وماصة بها الى microinjection العفن الدرج. ضبط الوقت حقن مكروي لتسليم 3 حتي 4 NL من في قفص فلوريسئين-ديكستران. تحت المجهر تشريح، قم بتوجيه الأجنة مع ملقط وحقن (3 إلى 4 NL) في قفص فلوريسئين-ديكستران صواريخ على القاعدة التي من الخلايا قسيم أرومي (قسيم أرومي-صفار واجهة). ينبغي للالمرحلة الجنين للحقن تكون 1 - إلى 2-الخلية المرحلة.
- بعد الحقن، قم بإزالة الأجنة من حقن مكروي علبة العفن ومكان لهم في طبق بتري نظيفة التي تحتوي على الطازجة أسماك المياه. ولا يجوز أن تضاف زرقاء الميثيلين إلى الماء الأسماك لمنع نمو الفطريات عند تركيز النهائي من عند 0.02٪ ث / V. تغطية الطبق بتري مع احباط المعدن، الى منع uncaging من المحقونة في قفص فلوريسئين-ديكستران.
- رفع الأجنة حقن إلى مرحلة لعندما الخلايا من الفائدة تحتاج إلى يتم photoactivated. لتنشيط ضوئي، وإعداد أ 0.6٪ منخفضة حل كريات الأغاروس ذوبان في DDH 2 O. يمكن أن اعتمادا على المسرح الجنين، Tricaine (MS222) يمكن ان تضاف الى كريات الأغاروس انصهار منخفضة. إلى قيام بذلك، تمييع 0،02 Tricaine٪ في كريات الأغاروس ذوبان من الأقل إلى تركيز النهائي من 0،0014٪.
- كما في أقرب وقت على الأجنة تصل إلى مرحلة مناسبة التنموية، dechorionate على الأجنة فى 1 وسائل الاعلام Danieau X مع ملقط. عندما dechorionating، وجعل متأكد من التي يتم وضعها عامل تصفية شفافة الأصفر في المسار من المصدر ان الضوء الأبيض (راجع الخطوة 2.3).
- تسخين 0.6٪ منخفضة حل كريات الأغاروس ذوبان إلى 37 ° C. ماصة 1 مل من كريات الأغاروس انصهار منخفضة في البئر لأحد ساترة LabTek الشريحة يحتل هيئة تشريعية. جبل بعناية 3 حتي 4 الأجنة في كريات الأغاروس انصهار منخفضة وأورينت لهم مع ملقط مع الخلايا ليتم photoactivated التي تواجه نحو الانخفاض ضد ساترة القاع.
- تسمح للكريات الأغاروس إلى يصلب. بعد التصلب، ماصة 1 مل من 1 وسائل الاعلام Danieau X على مدى كريات الأغاروس.
- كرر الخطوات 2،8 حتي 2،9 للحصول على مزيد الأجنة.
3. اثنين من-الفوتون التنشيط من في قفص فلوريسئين-ديكستران
* يفترض هذا الإجراء إلى أن الجنين يعرب عن لما نشرهR GFP. يتم تم الاطلاع عليها الجنين باستخدام أيون الأرجون (488 نانومتر) مصدر ليزر التي تعلق على 510 LSM المجهر NLO META. يتم تحديد A الخلية GFP واحدة الإيجابية وphotoactivated باستخدام تاي ماي ليزر (ليزر الفيمتو ثانية) يقترن إلى LSM 510. الإجراء هو نفسه بالنسبة لغير-الفلورسنت الأجنة. وبدلا من ذلك يمكن أن، يمكن استخدام الضوء الأبيض للعثور على الخلية إلى يمكن تنشيط، تليها من قبل التنشيط باستخدام مصدر ماي ليزر تاي.
- تحميل LSM 510 البرمجيات. ضع عامل تصفية شفافة الأصفر في المسار شعاع الضوء الأبيض.
- حدد مسح صورة وجديدة و انقر فوق ابدأ الوضع الخبراء.
- حدد علامة التبويب ليزر. بدوره على أيون الأرجون (488 نانومتر) وماي تاي (الفيمتو ثانية) مصادر ليزر.
- تعيين تاي ماي الطول الموجي إلى 740 نانومتر.
- حدد علامة التبويب التكوين. تعيين التكوين المسار البصرية من أجل أيون الأرجون وماي ليزر تاي.
- حدد علامة التبويب المسح الضوئي. تغيير ويتمثل الهدف إلى 20X/0.8.
- تعيين سرعة المسح الضوئي MAX بواسطة النقر فوق ماكس.
- الوضع مجموعة، أسلوب، وعدد إلى الخط. وكان متوسط، و 1.
- تحت قم بإلغاء تحديد على المفتاح Tab القنوات جميع مصادر ليزر ما عدا لتاي ماي.
- وضع السلطة متر في المسار شعاع البصرية.
- حدد زر للمقاولات لتنشيط المسح الضوئي المستمر.
- ضبط مستوى٪ ناقل حركة حتى السلطة متر يقرأ أحد قوة الليزر متوسط من 47 ميغاواط.
- وقف المسح الضوئي عن طريق اختيار فوق الزر إيقاف.
- تحت علامة التبويب القنوات قم بإلغاء تحديد مصدر ماي ليزر تاي وحدد أيون الأرجون (488 نانومتر).
- حدد زر س ص وجبات سريعة. تحت علامة التبويب القنوات ضبط مستوى ثقب الدبوس، تحقيق مكاسب كاشف، مكبر للصوت الإزاحة، وتحقيق مكاسب مكبر للصوت لليزر أيون الأرجون لتحقيق على أفضل جودة الصورة.
- باستخدام وحدة تحكم المرحلة، والعثور على والتركيز على الخلية لتنشيط.
- انقر فوق الزر إيقاف.
- استخدام الزوم أداة، والتكبير في على الخلية المفعلين يمكنهم حتى عامل التكبير تحت علامة التبويب الوضع يعرض 50 حتي 70.
- وقف المسح الضوئي عن طريق اختيار فوق الزر إيقاف.
- تحت قم بإلغاء تحديد على المفتاح Tab القنوات على أيون الأرجون لاسإيه (488 نانومتر) وحدد تاي ماي ليزر.
- تحت علامة التبويب الوضع تعيين سرعة المسح الضوئي إلى 31،46 ثوانى.
- حدد زر واحدة لبدء تشغيل المسح الضوئي لمدة سنتين-الفوتون التنشيط من في قفص فلوريسئين-ديكستران من الخلية المحددة.
- بعد التنشيط، قم بإلغاء تحديد تاي ماي ليزر تحت علامة التبويب القنوات، وإعادة تحديد أيون الأرجون ليزر (488 نانومتر).
- تعيين عامل التكبير في إطار طريقة التوريد إلى 1، وانقر فوق على زر ماكس تحت سرعة يتوجه الى تعيين سرعة أسرع المسح الضوئي.
- حدد س ص وجبات سريعة من يكتب نصيحة المنطقة photoactivated. التحقق من أن المنطقة photoactivated هو لا ليزر ذاب. للحصول على مزيد من المعلومات حول التذرية ليزر، يرجى الرجوع إلى المقطع المناقشة.
- كرر الخطوات أعلاه للحصول على الأجنة غيرها من.
4. كشف مناعي من uncaged فلوريسئين-ديكستران (مقتبس من الرقم المرجعي. 16)
- بعد photoativation، ضع عامل تصفية شفافة الصفراء في الجبهة من المصدر ان الضوء الأبيض وإزالة يدويا في كل الجنين من Lآه كريات الأغاروس ذوبان باستخدام ملقط حادة. إخضاع جميع الأجنة إزالة في طبق بتري جديدة التي تحتوي على الطازجة 1 X Danieau وسائل الاعلام. تغطية الطبق بتري مع احباط المعدن، الى منع التعرض من الأجنة للضوء.
- إذا لزم الأمر، والعمق على الأجنة إلى المرحلة على التنموية المطلوب. في هذه الأثناء، وإعداد التوصل إلى حل بارافورمالدهيد 4٪ (انظر إعداد من حلول). قسامة 1.5 مل من بارافورمالدهيد محضرة إلى أنبوب microcentrifuge.
- بعد الأجنة قد وصلت إلى المرحلة التنموية من الفائدة، ماصة على الأجنة في أنبوب microcentrifuge (من الخطوة 4.2). تغطية أنبوب مع احباط المعدن، الى منع التعرض للضوء.
- Nutate الأنبوب بين عشية وضحاها في تمام الساعة 4 ° C. لليوم التالي إعداد متدرج الإيثانول (EtOH) الحلول في الفوسفات المخزن المؤقت المالحة (PBS) وDDH O 2؛ EtOH 30٪: PBS، EtOH 50٪: PBS، EtOH 70٪: DDH O 2، وEtOH 100٪.
- في اليوم التالي، قم بإزالة الأجنة من C. ° 4 إزالة احباط معدنية التي تغطي أنبوب ونضح بسرعة قبالة الفقرةformaldehye (تترك وراءها وحدة تخزين الصغيرة التي هو بما فيه الكفاية لتغطية الأجنة). ماصة 1.5 مل من EtOH 30٪: PBS في أنبوب. إعادة-تغطية أنبوب مع احباط معدنية. Nutate الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق درجة.
- كرر الخطوة 4،5 باستخدام 50، 70، و 100٪ متدرج حلول EtOH. بعد ان يغسل EtOH 100٪، وشطف على الأجنة مرة أخرى في EtOH 100٪ لمدة 10 دقائق درجة.
- بعد يغسل، قم بتخزين الأجنة بين عشية وضحاها في -20 ° C. لليوم التالي إعداد الفوسفات تخزينها مؤقتا توين (PBT، وانظر إعداد من حلول)، و 5 X المخزن المؤقت حظر (انظر البروتوكول بالشركة المصنعة للحصول الإعداد)، وحامض المالئيك (بروتوكول للإعداد يمكن أن يمكن العثور عليها في بروتوكول المخزن المؤقت عرقلة)، و 10 ملغ / [مل] بروتيناز K، وأ الأجسام المضادة X 10 الحل (المضادة للفلوريسئين-AP، وانظر إعداد من حلول).
- أيضا بإعداد 2٪ لحم الضأن في مصل الدم (LS، وانظر إعداد من حلول) مخففة في PBT. تخزين الأجسام المضادة في تمام الساعة 4 ° C تهز بين عشية وضحاها على nutator. يمكن أن تظل على LS 2٪ عند C. ° 4
- في اليوم التالي إزالة الأجنةمن C. -20 ° إزالة احباط معدنية التي تغطي أنبوب ونضح بسرعة قبالة EtOH 100٪. إضافة 1.5 مل من EtOH 70٪: DDH 2 O إلى الأنبوب. إعادة-تغطية أنبوب مع احباط معدنية. Nutate الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق درجة.
- كرر الخطوة 4،8 باستخدام 50 و 30٪ متدرج حلول EtOH، وPBT 100٪. بعد ان يغسل PBT 100٪، وشطف على الأجنة المزيد 3 مرات في PBT 100٪ لمدة 10 دقائق درجة.
- إذا كان الأجنة هم من كبار السن من 24 ساعة، بروتيناز K علاج لهم. إن لم يكن، والمضي قدما إلى الخطوة 4.13. إلى قيام بذلك، تمييع محضرة بروتيناز K (الخطوة 4.7) 1:1000 في PBT. احتضان على الأجنة في K بروتيناز لمدة 10 دقائق درجة، أو لفترة أطول إذا كان الأجنة هم من كبار السن. حفاظ على الأجنة غطت مع احباط المعدن، الى منع التعرض للضوء.
- بعد العلاج K بروتيناز، وغسل الأجنة 5 مرات في PBT لمدة 10 دقائق درجة. بعد الغسيل، إصلاح الأجنة في بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 30 دقائق درجة في درجة حرارة الغرفة على nutator. بعد ذلك، وغسل على الفور الأجنة 5 مرات في PBT لمدة 10 دقائق درجة. حفاظ على الأجنةغطت مع احباط المعدن، الى منع التعرض للضوء.
- جعل المخزن المؤقت حظر بواسطة تمييع 5 X عرقلة المخزن المؤقت في المخزن المؤقت حمض المالئيك إلى 1 X. قم بإزالة الأجنة من PBT و يضعهم في 1 X عرقلة المخزن المؤقت. تغطية الأجنة مع احباط معدن، وnutate لهم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 إلى 6 ساعات.
- بعد 5 الى 6 ساعات من حظر، الصدمة الحرارية على الأجنة عند 65 ° C لمدة 15 إلى 20 دقيقة.
- يجب الحصول على حل الأجسام المضادة وعلى LS 2٪ أعدت في اليوم السابق. أجهزة الطرد المركزي الحل الأجسام المضادة في دورة في الدقيقة كحد أقصى. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب LS 2٪. عكس الأنبوب لخلط.
- نقل الأجنة من حظر المخزن المؤقت إلى خليط LS-الأجسام المضادة. حفاظ على الأجنة غطت مع احباط المعدن، الى منع التعرض للضوء. Nutate على الأجنة في تمام الساعة 4 بين عشية وضحاها C °.
- في اليوم التالي غسل الأجنة في درجة حرارة الغرفة 6 مرات لمدة 15 دقائق درجة في PBT. إعداد AP المخزن المؤقت (انظر إعداد من حلول).
- غسل الأجنة في درجة حرارة الغرفة 2 مرات لمدة 10 دقائق درجة في بو APffer. إعداد NBT / حل BCIP النامية (انظر إعداد من حلول).
- نقل الأجنة إلى NBT / BCIP. تسمح للوصمة عار لتطوير في الظلام.
- وقف التنمية عن طريق الغسيل على الأجنة 3 مرات في PBT لمدة 5 دقائق درجة لكل منهما.
- لالحصول على الصور تركيب والأجنة في 0.6٪ منخفضة ذوبان كريات الأغاروس أو ميثيل سيلولوز 3٪، والحصول على صور باستخدام مجهر مجمع مقلوب أو في وضع مستقيم.
- يمكن أن أن يتم تخزين عينات Photoactivated للتحليل المستقبل (تلطيخ لا تزال مستقرة) من قبل التجفيف لهم في يغسل EtOH متدرج. اتبع الخطوات من 4،4 من خلال 4،7 لالتجفيف العينات.
5. ممثل النتائج:
الشكل 1. تنشيط ضوئي من في قفص فلوريسئين-ديكستران. (A B،) Brightfield وصورة مضان لأحد الجنين طريقة العرض الزرد الجانبي في مرحلة 13/14-somite قبل تنشيط ضوئي. (C، D) تم photoactivated والجنين أر the13/14-somite المرحلة في واحدة من و somites (السهم) مع طول موجة من 740 نانومتر والمسح الضوئي الوقت المؤرخ 31 ثوان، وأحد قوة الليزر متوسط من 47 ميغاواط. في مرحلة ما بعد التنشيط، (د) لوحظ مضان من uncaged فلوريسئين-ديكستران. التوجه: الظهرية (اليمين)، بطني (إلى اليسار). نطاق وبار 100 ميكرون.
الشكل 2. كشف مناعي من في قفص فلوريسئين-ديكستران. الشكل 2 يصور المناعية من uncaged فلوريسئين-ديكستران في الجنين 18/19 الزرد HPF. في مرحلة 10-الجسيدة تم تفعيل وهي منطقة صغيرة من الجنين في الأديم المتوسط لوحة الجانبي باستخدام المعلمات ليزر نفس وذكر في الشكل 1. باستخدام الإجراء كشف مناعي، فوق السهم الموجود ويحدد هذا المنطقة المنشط مع تلطيخ الخلفية الحد الأدنى من. التوجه: الظهرية (أعلى)، بطني (القاع). نطاق وبار 100 ميكرون.
Discussion
وتصف هذه الورقة طريقة تنوعا لواحدة خلية تعيين مصير استنادا إلى تنشيط ضوئي من قفص فلوريسئين-ديكستران. Uncaging من قفص فلوريسئين-ديكستران في الخلايا واحدة ويتحقق باستخدام اثنين من الفوتون امتصاص من الفيمتو ثانية ماي الليزر تاي بالإضافة إلى المجهر LSM زايس META 510 مبائر. Uncaged فلوريسئين-ديكستران في الخلايا photoactivated هو تصور بسرعة باستخدام إجراء المناعية بسيطة.
في هذا البروتوكول الطول الموجي امتصاص ثنائي الفوتون لتنشيط ضوئي من قفص فلوريسئين-ديكستران هو 740 نانومتر. تم تحديد تجريبيا هذا الطول الموجي من photoactivating قفص فلوريسئين-ديكستران الأجنة wildtype حقن. وقد تباينت الطول الموجي الإثارة الليزر 600 حتي 800 نانومتر، وكان مصمما نوعيا وجود أو عدم وجود مضان فلوريسئين تفعيل بعد. وجدنا أن 740 نانومتر ينتج إشارة فلوريسئين تفعيل أقوى التالية. ومن الناحية المثالية، ينبغي أن 740 نانومتر العمل للجميعنظم نموذجية، ومع ذلك، فإننا ننصح اختبار مجموعة من موجات لتحديد الأمثل الطول الموجي الإثارة ثنائي الفوتون لعينتك.
في قفص حقن فلوريسئين-ديكستران الأجنة wildtype، لكل طول موجي الإثارة ثنائي الفوتون نحن اختبار تفاوتت أيضا قوة الليزر المتوسط. لطول موجة الإثارة من 740 نانومتر، وهي قوة الليزر المتوسط من 47 تنتج ميغاواط إشارة أقوى فلوريسئين في المنطقة المنشط بالمقارنة مع خفض القوى الليزر المتوسط. لم العالي القوى الليزر العادي لا ينتج إشارات أقوى فلوريسئين، ولكن الاجتثاث الناجم عن الأنسجة. منذ نبضات الليزر الفيمتو ثانية هي فعالة في الأنسجة البيولوجية ablating 15، نوصي تحديد الليزر متوسط طاقة عتبة تنشيط ضوئي أن يتجنب الاجتثاث الأنسجة.
ثنائي الفوتون امتصاص يحدث خلال حجم التفاعل الصغيرة. لضمان تفعيل السليم للقفص فلوريسئين-ديكستران، يجب أن توضع الخلية في الخشوع. في اله فوق البروتوكول، وتصويرها في وقت واحد الخلايا GFP إيجابية تحت الضوء الأبيض لتأكيد التركيز الخلية. لذلك، بيضاء اكتساب ضوء بالإضافة إلى قنوات أخرى من المستحسن. بعد التأكد من تركيز الخلية، بروتوكول لدينا تشير إلى تعظيم خلية المنشط. ويقترح وهناك عامل التكبير من 50 إلى 70، ولكن هذه القيمة يعتمد على حجم الخلية المختارة. زيادة التكبير يعزل الخلية المنشط من الخلايا المجاورة، ويحد منطقة المسح الضوئي لمدة الفوتون التنشيط. من الناحية المثالية، ينبغي أن منطقة المسح الضوئي تغطي مساحة واسعة من الخلية.
الكشف عن واحدة الخلايا تفعيلها يتطلب أن تلطيخ الخلفية يكون ضئيلا للغاية. في بروتوكول مناعي أعلاه فإنه من المهم أن يتم حظر العينة في حجب العازلة لمدة 5 إلى 6 ساعات (الخطوة 4.13). عند وضع مع NBT / BCIP، ينبغي uncaged فلوريسئين-ديكستران تصبح مرئية خلال 10 إلى 20 دقيقة. إذا تلطيخ خلفية قوية، نقترح يغسل يعد حظر الوقت وإضافية لإزالة مكافحةالجسم (الخطوة 4.17).
الأرقام 1 و 2 تقديم نتائج ممثل تنشيط ضوئي ومناعي. في الشكل 1، 1 في وقت مبكر - تم حقن ل2-الخلية الأجنة wildtype المسرح مع قفص فلوريسئين-ديكستران. وأثيرت الأجنة لsomitogenesis المتوسطة والتي تقام في الاغاروز انصهار منخفضة في الاتجاه الجانبي. الشكل 1 (أ، ب) تصور brightfield والصور الفلورسنت من الجنين قبل تنشيط ضوئي. ويتجلى دليل على أن الجنين لا يزال uncaged بسبب عدم وجود مضان فلوريسئين في الشكل 1 (ب). تم تفعيل منطقة صغيرة داخل الجسيدة مع طول موجة من 740 نانومتر لمدة 31 ثانية باستخدام قوة الليزر المتوسط من 47 ميغاواط، الشكل 1 (ج؛ السهم). حدث بعد تفعيل، واثنين من الفوتون uncaging من فلوريسئين-ديكستران كما يتضح من مضان من منطقة تفعيلها، الشكل 1 (د؛ السهم). لم تكن مصحوبة التنشيط من خلال التذرية الليزر، حيث أن الأنسجة somitic ظلت على حالها، الشكل 1 (ج). الشكل 2 يوضح مناعي من فلور uncaged escein-ديكستران. وphotoactivated منطقة صغيرة في الأديم المتوسط وحة الجانبية للجنين المرحلة 10-الجسيدة باستخدام المعلمات ليزر نفس المذكورة في الشكل 1. تم رفع الجنين ومعالجتها باستخدام الخطوات 4،1 من خلال 4،20. السهم في يقع 2 الشكل المنطقة تفعيلها، كما يدل على ذلك تراكم راسب أزرق. تم الكشف بوضوح فقط موقع المنشط دون التدخل تلطيخ الخلفية.
إعداد الحلول:
1 X PBT (1 L)
100 مل 10 X PBS
2 غرام BSA
10 مل توين 20٪
10 X PBS (1 L)
80 جم كلوريد الصوديوم
2 غرام بوكل
6،1 ز نا 2 HPO 4
1،9 ز KH 2 PO 4
DDH 2 O إلى 1 L
الرقم الهيدروجيني إلى 7.3
4٪ لامتصاص العرق (160 مل)
32٪ لامتصاص العرق (كل منهما 10 قارورة مل)
8 مل 20 X PBS
132 مل DDH 2 O
1 مل 5 M كلوريد الصوديوم
2.5 مل 1 M MgCl 2
5 مل 1 M تريس الرقم الهيدروجيني 9،5
250 ميكرولتر توين 20٪
41،25 مل DDH 2 O
حل الأجسام المضادة (لمدة 1 العينة)
5،5 مسحوق الأسيتون ميكرولتر
40 PBT ميكرولتر
0،8 LS ميكرولتر
0.1 ميكروليتر مكافحة فلوريسئين-AP الأجسام المضادة
2٪ LS (360 ميكرولتر لمدة 1 العينة)
7،2 ميكرولتر LS 100٪
352،8 PBT ميكرولتر
1 X Danieau وسائل الإعلام (1 L) ‡
11،6 5 مل M كلوريد الصوديوم
700 ميكرولتر 1 M بوكل
400 ميكرولتر 1 M MgSO 4
600 ميكرولتر 1 M كا (NO 3) 2
5 مل 1 HEPES M
DDH 2 O إلى 1 L
درجة الحموضة ضبط إلى 7.6
‡ Danieau هو الحل الملح مثالية لتربية الأجنة الزرد dechorionated. شريطة أن يمكن استخدام وسائل الإعلام الأخرى، والحلول متساوي التوتر مع بروperly الأسمولية (~ 300 الميلي أسمول لالزرد)
NBT الأسهم (1 مل)
50 ملغ نيترو الأزرق تترازوليوم
0،7 مل أنهيدريد الفورماميد ثنائي ميثيل
0.3 مل DDH 2 O
BCIP الأسهم (1 مل)
50 ملغ 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl الفوسفات
1 مل أنهيدريد الفورماميد ثنائي ميثيل
NBT / BCIP حل النامية
1 مل AP العازلة
4،5 الأسهم NBT ميكرولتر
3،5 الأسهم BCIP ميكرولتر
الأسيتون مسحوق
- حدد 20 سمكة الكبار وتجميدها في النيتروجين السائل.
- طحن الأسماك المجمدة مع بمدافع الهاون والمدقه إلى مسحوق.
- نقل مسحوق الأسماك في أنبوب 50 مل المخروطية.
- ملء الأنبوب المخروطية مع الأسيتون 100٪. دوامة الأنبوب.
- تدور الأنبوب في دورة في الدقيقة كحد أقصى لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف.
- غسل بيليه آخر 3 مرات في الأسيتون 100٪ وتدور الأنبوب في دورة في الدقيقة كحد أقصى لمدة 10 دقيقة. Bيجب Y غسل مشاركة طاف تظهر واضحة.
- إضافة 100 الأسيتون٪ إلى بيليه مرة أخرى، والسماح للأنبوب تصل إلى درجة حرارة الغرفة. فإن جزيئات أكثر كثافة تسوية، في حين أن الجسيمات الدقيقة ستبقى في التعليق.
- صب على الجسيمات الدقيقة في أنبوب جديد. قسامة الحل مسحوق في أنابيب منفصلة وتخزينها في -20 درجة مئوية.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر J. تشن لتوفير قفص بروتوكول التوليف فلوريسئين-ديكستران. وأيد هذا البحث من قبل شهر مارس من جائزة الدايمات 5 FY09-78، أمريكا جائزة جمعية القلب 09BGIA2090075، وجائزة NIH / NHLBI R01 HL107369-01 لSS A الخاصة. شكرا لClosson C. للمساعدة المجهري له
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CMNB-caged fluorescein SE | Invitrogen | C20050 | |
| 10 kDa Aminodextran | Invitrogen | D1860 | |
| Zeba Desalt Spin Column | Pierce, Thermo Scientific | 89889 | |
| Low melting agarose | Amresco | 0815-100G | |
| Sodium Borate | Amresco | 1131117-100G | |
| Tricaine Methylsulfonate/ MS222 | Research Organics | 1347A | |
| Anti-fluorescein-AP | Roche Group | 11376622 | |
| Blocking buffer | Roche Group | 11 096 176 001 | |
| Maleic Acid | Sigma-Aldrich | MO375-500G | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| NBT | Sigma-Aldrich | I8377-250mg | |
| BCIP | Fisher Scientific | PI-34040 | |
| Microinjector | Harvard Apparatus | PLI-2000 | |
| LabTek chambered coverglass slides | Nalge Nunc international | 155380 | |
| Proteinase K | Invitrogen | AM2544 | |
| Lamb serum | Invitrogen | 16070096 | |
| LSM 510 META NLO | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 20X 0.8 NA Air apochromatic objective | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Transparent yellow filter | Theatre House Inc. | Roscolux filter sheet Color: 312 |
References
- Mathur, J. mEosFP-based green-to-red photoconvertible subcellular probes for plants. Plant physiology. 154, 1573-1587 Forthcoming.
- Wiedenmann, J. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 15905-15910 (2004).
- Subach, F. V. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature. 6, 153-159 (2009).
- Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein. Nature protocols. 1, 960-967 (2006).
- Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
- Watanabe, W. Single-organelle tracking by two-photon conversion. Optics express. 15, 2490-2498 (2007).
- Warga, R. M., Kane, D. A., Ho, R. K. Fate mapping embryonic blood in zebrafish: multi- and unipotential lineages are segregated at gastrulation. Developmental cell. 16, 744-755 (2009).
- Chudakov, D. M. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nature. 21, 191-194 (2003).
- Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PloS ONE. 3, e3944-e3944 (2008).
- Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos. BMC developmental biology. 9, 49-49 (2009).
- Stark, D. A., Kulesa, P. M. An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model. Dev Dyn. 236, 1583-1594 (2007).
- Zhong, T. P., Childs, S., Leu, J. P., Fishman, M. C. Gridlock signalling pathway fashions the first embryonic artery. Nature. 414, 216-220 (2001).
- Vogeli, K. M., Jin, S. W., Martin, G. R., Stainier, D. Y. A common progenitor for haematopoietic and endothelial lineages in the zebrafish gastrula. Nature. 443, 337-339 (2006).
- Clanton, J. A., Shestopalov, I. A., Chen, J. K., Gamse, J. T. Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran. J. Vis. Exp. (50), e2672-e2672 (2011).
- Niemz, M. H. Laser-Tissue Interactions: Fundamentals and Applications. , Springer. (2003).
- Jowett, T. Analysis of protein and gene expression. Methods in cell biology. 59, 63-85 (1999).
