量化G蛋白偶联受体上的激动剂活性

摘要

本文描述了一种用于估算激动剂对G蛋白偶联受体活性状态亲和常数（K_b）的方法。该分析可提供K_b的绝对值或相对值，具体取决于受体的组成性激活是否可测量。本方法适用于受体激活后产生的多种下游反应。

摘要

当激动剂激活一群G蛋白偶联受体（GPCRs）时，会引发一条信号通路，最终导致细胞或组织产生反应。该过程可在单个受体、受体群体或下游反应水平上进行分析。本文介绍如何分析下游反应，以估算激动剂对单个受体活性状态的亲和常数。

受体表现为量子化开关，可在活性状态与非活性状态之间交替转换（图1）。活性状态可与特定的G蛋白或其他信号分子伙伴相互作用。在无配体存在时，受体主要处于非活性状态。激动剂的结合会提高受体转换为活性状态的概率，因为其对活性状态的亲和常数（K_b）远大于对非活性状态的亲和常数（K_a）。群体中所有受体随机输出信号的总和，随时间表现为恒定水平的受体激活。引起半最大受体激活的激动剂浓度的倒数，相当于观测到的亲和常数（K_obs），而处于活性状态的激动剂-受体复合物所占的比例定义为效能（ε）（图2）。

已开发出用于分析G蛋白偶联受体（GPCR）下游反应的方法，可用来估算激动剂的K_obs值及其相对效能^1,2。在本报告中，我们展示了如何改进该分析方法，以估算一种激动剂相对于另一种激动剂的K_b值。对于具有组成型活性的检测体系，我们进一步展示了如何以M^-1为绝对单位来估算K_b值。

我们分析激动剂浓度-反应曲线的方法^3,4采用基于操作模型⁵的全局非线性回归。本文描述了使用软件Prism（GraphPad Software, Inc., San Diego, CA）的操作流程。该分析可得到观察解离常数K_obs与一个与效能成正比的参数（τ）的乘积估计值。一种激动剂的τK_obs估计值除以另一种激动剂的对应值，即为K_b (RA_i) ⁶的相对度量。对于任何具有组成性活性的受体，均可估算出一个与游离受体复合物效能成正比的参数（τ_sys）。在此情况下，激动剂的K_b值等于τK_obs/τ_sys ³。

我们的方法可用于确定激动剂对受体亚型的选择性，并可量化激动剂-受体通过不同G蛋白的信号传导。

方案

1. 激动剂浓度-反应曲线的测定：无组成型活性

1. 为了估算相对激动剂的 K_b 值（RA_i），至少需要一系列两条以上的激动剂浓度-反应曲线。只要能够控制激动剂浓度，并且反应由单一类型的受体介导，任何可用于检测 GPCR 功能反应的 体外 实验均可使用。合适的基于细胞的检测方法包括测定表达重组受体的细胞系中 cAMP ^4,7 和肌醇磷酸的累积 ^8,9。整体组织实验的示例包括测定平滑肌的收缩 ¹⁰，或通过场刺激的大鼠左心房中 M₂ 毒蕈碱受体和 β₁-肾上腺素能受体介导的收缩变化 ¹¹。
2. 选择一组包含高效力激动剂（例如内源性配体）在内的激动剂进行分析。在单次实验中，测定每种激动剂的完整浓度-反应曲线。如果激动剂数量过多，无法在一次实验中完成全部检测，则将激动剂分为若干亚组，每个亚组包含可在单次实验中合理处理的激动剂数量。对每个亚组，同时测定高效力激动剂与其他激动剂的浓度-反应曲线（见图3）。根据数据的变异性，每个亚组重复实验约 3 至 6 次。
3. 对每条浓度-反应曲线，测量无激动剂时的反应（基础反应）以及激动剂浓度递增时的反应。激动剂浓度应在对数尺度上均匀分布，间隔约为 0.3 - 0.7 log₁₀ 单位，覆盖整个反应范围并确定....

讨论

由于我们估算RA_i（相对K_b值）的方法仅需测定激动剂的浓度-反应曲线，因此只要测定了这些曲线，即可随时进行分析。

如果实验体系（例如细胞或组织）的反应在不同天之间存在较大日间变异，则可将每条浓度-反应曲线的反应测量值相对于当天标准激动剂的“Top”估计值进行归一化。通过回归分析（如第2和第5节所述），对标准激动剂的每条重复浓度-反应曲线分别估算其Top和log EC₅₀值。将当天所有激动剂浓度-反应曲线的反应值相对于该天标准激动剂的Top估计值进行归一化处理。随后，对这些归一化后的数据按照第3节起所述方法进行分析。

准确估算 K_b 依赖于对受体组成型活性的精确测定。在本实验中，将 M₃ 受体转染至 HEK 293 细胞后，导致磷脂酰肌醇水解增加，在使用 [3H]肌醇预标记并加入锂的细胞中测得的 [³