Summary
نحن يبرهن على وجود طريقة بسيطة لوضع الخلايا في الأماكن المطلوبة على ركيزة. هذا الأسلوب أنماط الخلايا بواسطة رقاقة السيليكون التقليب microwells تحتوي على خلايا مملوءة الركيزة. هذا الأسلوب يوفر طريقة جديدة لتعديل الإشارات وإنتشاري juxtacrine بين الخلايا.
Abstract
الخلايا التي تتكون من خلية التفاعلات يشير إنتشاري وخلية خلية الاتصال (إشارات juxtacrine) مهمة في العديد من العمليات البيولوجية ، مثل نمو الورم ، وتمايز الخلايا الجذعية ، والخلايا الجذعية الذاتية التجديد. وهناك عدد من الطرق الموجودة حاليا لتعديل إشارات الخلايا في المختبر. أسلوب واحد من المبلغ الإجمالي للتحوير الإشارة هو إنتشاري تختلف كثافة البذر الخلية خلال الثقافة. نظرا لطبيعة عشوائية من بذر الخلية ، وينتج عن هذا التفاوت الكبير في تباعد الخلية الخلية الفعلي وكمية من الخلايا خلية الاتصال ، ولا يمكن أن تفرض على البيئة المحلية. نهج أكثر تحديدا للإشارة الخلية تحوير لاستخدام مثبطات الجزيئية أو النهج الوراثية لاسقاط اشارة محددة البروتينات ، ولكن هي الأنسب كل من هذه الأساليب لمعالجة عدد قليل من الجزيئات. هنا ، ونحن يبرهن على وجود نهج جديد للإشارات الخلية خلية تحوير أن ينظم البيئة المحلية من مجموعة من الخلايا عن طريق وضع أرقام مختلفة من الخلايا في الأماكن المطلوبة على ركيزة. هذا الأسلوب يوفر وسيلة مكملة للتحكم في الإشارات المحلية وإنتشاري juxtacrine بين الخلايا. لدينا أسلوب يجعل من استخدام المعالج فليب بيو (BFC) ، رقاقة السيليكون microfabricated تحتوي على مئات إلى آلاف microwells ، كل عقد الحجم إما خلية واحدة أو عدد قليل من الخلايا. نحن مع تحميل رقاقة خلايا ببساطة عن طريق pipetting لهم على مجموعة من الآبار وغسل خلايا تفريغ قبالة الصفيف. ومن ثم انقلبت على الشريحة ركيزة ، حيث الخلايا تسقط من الآبار وعلى الركيزة ، والحفاظ على الزخرفة. بعد الخلايا قد تعلق ، يمكن إزالة الرقاقة (أو اليسار على). هذا النهج في الزخرفة الخلية هي فريدة من نوعها من حيث أنها : 1) لا يغير من كيمياء الركيزة ، وبالتالي السماح الخلايا على التكاثر والهجرة ؛ 2) يسمح الزخرفة على أي الركيزة ، بما في ذلك الأنسجة الثقافة البوليسترين والزجاج وmatrigel و المغذية حتى طبقات الخلية ؛ و 3) متوافق مع microcontact الطباعة التقليدية ، والسماح بإنشاء الجزر المصفوفة خارج الخلية مع الخلايا وضعها داخل تلك الجزر. في هذا الفيديو ، نبدي الزخرفة من الخلايا الجذعية الجنينية على الأنسجة الثقافة البوليسترين باستخدام BFC.
Protocol
جعل BFC
تتم بواسطة BFCs polydimethylsiloxane صب (PDMS) على مدى 4 "رقاقة رئيسية سي.
صنع رقاقة رئيسية
- تبدأ في تجفيف رقائق سي لمدة 30 دقيقة في 130 درجة مئوية.
- وضع رقاقة على المغطي الجانبية ، صب SU8 - 2050 (Microchem) على رقاقة ، المنحدر من 300 ق / دورة في الدقيقة إلى 3000-4000 دورة في الدقيقة ، وتدور لمدة 30 ق لانتاج مرتفعات ميزة 40-30 ملم على التوالي.
- بعد الغزل ووضع رقاقة على 65 درجة مئوية موقد ، المنحدر فورا درجة الحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة 5-6 دقيقة ، والمنحدر ثم انخفضت إلى 65 درجة مئوية.
- تعرض رقائق لجرعة الأشعة فوق البنفسجية من 200 ميغا جول / سم 2 على اليجنر الاتصال باستخدام قناع الظلام الميداني.
- وضع رقائق على موقد 65 درجة مئوية ، المنحدر فورا درجة الحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة دقيقة 4-5 ، ومن ثم المنحدر إلى أسفل إلى 65 درجة مئوية.
- تطوير رقائق في خلات مساء والأيزوبروبانول.
- Silanize رقائق لمدة 30 دقيقة باستخدام hexamethyldisiloxane (شين ايتسو MicroSi) ، أو (Tridecafluoro - 1 - ،1،2،2 tetrahydrooctyl) - 1 - trichlorosilane (t2492 الروضة UCT التخصص ، وبريستول ، والسلطة الفلسطينية) ، لمنع من PDMS التمسك رقاقة رئيسية سي.
صب رقائق
- مزيج PDMS (داو كورنينغ ، Sylgard 184) في نسبة 10:1 ، سكبه على رقاقة سيليكون الرئيسي (~ 15 غ لكل رقاقة) ، والسماح لها علاج في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
- قشر الشفاء PDMS قبالة رقاقة سيليكون وقطع كل شريحة باستخدام شفرة حلاقة.
- السندات كل شريحة إلى شريحة المجهر قطع 1x1 سم لسهولة التعامل.
إعداد BFC للاستخدام
- نقع في ليلة وضحاها BFC PBS من أجل منع امتصاص وسائل الاعلام في PDMS أثناء التجربة.
- تجفيف الرقائق مع Kimwipe (Kimtech العلوم).
- وضع قطرة من 7.5 ٪ الأبقار مصل الزلال (BSA) (~ 200 مل) على السطح المزخرف من BFC ، ومن ثم كشط مع تلميح ماصة لتفريق جيش صرب البوسنة وإزالة أي فقاعات من الآبار.
- ترك الجيش الصربي البوسني على سطح BFC للا يقل عن 0.5 ساعة. تستنهض الهمم مثالي BSA كل 15 دقيقة لمنع تقشر.
- لتناسب BFC داخل صحن 35x10 ملم مشروعات برنامج التعاون الفني (فالكون ، 35-3001) ، وقطع الطريق على حواف الصحن half مشروعات برنامج التعاون الفني حتى أسفل إلى أن ¾ "سوف مقاطع الموثق (مكتب مستودع) تناسب على حافة الطبق إلى الرقاقة والمشبك طبق معا.
- هل قطع طوقا (اطار على شكل مع حافة ملم 20'20 الخارجي ، 15'15 الحافة الداخلية ملم ، وسمك 250-500 ملم) من ورقة PDMS (المنتجات المتخصصة سيليكون) أو أي سيليكون أخرى ، وتطبيقه على الطبق باستخدام الملقط.
خلايا الزخرفة مع BFC
- تعقيم الطبق ، وحشية ، ورقاقة BSA المغلفة ، ومقاطع الموثق 2 تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 1 دقيقة.
- نضح جيش صرب البوسنة وشطف BFC مرتين مع PBS مل 200.
- إضافة الجيلاتين إلى قطع طبق برنامج التعاون الفني إذا كان ذلك مطلوبا للخط الخلوي. خلاف ذلك ، والرطب على سطح مشروعات برنامج التعاون الفني مع بعض وسائل الاعلام قبل تطبيقه على شريحة (أنظر أدناه). هذا يمنع من تشكيل فقاعات في الغرفة.
- بعد الشفط في برنامج تلفزيوني ، ماصة 200 مل من محلول الخلية (~ 1 × 10 6 خلية / مل) على سطح BFC. السماح للخلايا لتسوية 5-10 دقيقة.
- إمالة BFC إلى زاوية واحدة بزاوية 15 درجة و~ ماصة ببطء حل الخلية قبالة مع 200 مل ماصة. ثم ، ومكان الشقة BFC وإضافة 100 مل من برنامج تلفزيوني أو وسائط فارغة إلى الزاوية BFC المعاكس. شطف BFC بهذه الطريقة إضافي 2-4 مرات ، حسب الاقتضاء ، لمسح كافة الخلايا من بين المناطق بشكل جيد.
- ماصة 200 مل من وسائل الاعلام على سطح الرقاقة. نضح الجيلاتين / وسائل الإعلام من برامج التعاون الفني. ثم عكس الطبق قبل المبللة ، ودفع ما يصل ببطء BFC ، في الطبق.
- تطبيق مقطع الموثق لكل منهما ، هما وجهان لغرفة لختم عليها. إزالة شوكات معدنية من مقاطع الموثق بحيث يبقى مستوى صحن عندما انقلبت.
- أخيرا ، والوجه بسرعة على الإعداد مع تجنب أي حركة لا لزوم لها ، وضعه في الحاضنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن بروتوكول والفيديو يظهر هنا وصف باستخدام 1 BFC إلى الخلايا الجذعية الجنينية الماوس نمط (mESCs) ، يمكن أن تستخدم لنقش BFCs عمليا أي نوع من الخلايا في المصالح. تغيير واحد فقط قد تحتاج إلى إجراء تغيير في حجم microwells. في تجربتنا ، لاستخدام الخلايا BFC لنمط واحد من آخر نوع من الخلايا ، وقطره microwell والارتفاع يساوي 10 ميكرون أكبر من قطر الخلية غير مرتبط يعمل بشكل أفضل.
ويمكن أيضا أن تستخدم لBFCs نمط الخلايا على ركائز أخرى ، بما في ذلك خلايا أخرى ، من دون تغييرات كبيرة في البروتوكول. الزخرفة على طبقة الخلايا الموجودة هي ميزة واحدة من النهج التقليدي BFC على النهج الزخرفة الخلية منذ celltypes معينة ، بما في ذلك المجالس الاقتصادية والاجتماعية وmESCs الإنسان ، وتحتاج إلى دعم أو الخلايا المغذية للحفاظ على النمط الظاهري على نحو سليم في مجال الثقافة.
طلب واحد من BFC أن نسعى لاستخدام BFC التحقيق عصبي بين خلايا الجذعية الجنينية. من جانب واحد في زرع خلايا الأسوار مربع مع المباعدة الشبكة المختلفة ، ونحن تعدل المعدل الذي يتم تبادل الإشارات بواسطة جزيئات الخلايا. من خلال جعل أكبر الآبار (التي يبلغ قطرها 40 ميكرون) ، ويمكننا أيضا جمع الأعداد الكبيرة (~ 20-10) خلايا في مكان معين ، وتغيير كثافة الخلية محليا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن نضع عددا من آبار صغيرة على مقربة من بعضها البعض ، مما أدى إلى وجود نمط الركيزة المحلية حيث الكثافة خلية من خلايا عالية ليست على اتصال. بهذه الطريقة ، يمكننا أن تعدل بشكل مستقل وقابل للانتشار juxtacrine إشارات بين الخلايا. وجود الخلايا في الشبكة أيضا يجعل من الاسهل بكثير لتعقب الخلايا على مدى عدة أيام. ونحن نعتقد أن سهولة الزخرفة الخلية مع BFC ستشجع الباحثين الآخرين لاستخدامها في دراستهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح EB007278.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Silicon master mould | |||
| Tissue culture dishes | Falcon BD | 35-3001 | 35 mm |
| 3/4" binder clips | |||
| PBS | |||
| hexamethyldisiloxane | Shin-Etsu MicroSi | ||
| New Item | MicroChem Corp. | SU8-2050 | |
| PM acetate | |||
| Isopropanol | |||
| BSA | 7.5% Bovine Serum Albumin |
References
- Rosenthal, A., Macdonald, A., Voldman, J. Cell Patterning Chip for Controlling the Stem Cell Microenvironment. Biomaterials. 28, 3208-3216 (2007).
