Двухслойный сотрудничества культуре первичных Крыса корковых нейронов и глии

Summary

Здесь мы предлагаем протокол для культивирования нейронов коры крысы в ​​присутствии глиальных слой подачи. Культурный нейронов установить полярность и создать синапсов, и может быть отделена от глии для использования в различных приложениях, таких как электрофизиологии, кальция изображений, анализы выживаемость клеток, иммуноцитохимия, и РНК / ДНК / белок изоляции.

Abstract

Это видео проведет вас через процесс культивирования нейронов коры головного мозга крысы в присутствии глиального питающего слоя, системы, известной как биламинар или модель совместного культивирования. Эта система подходит для различных экспериментальных нужд, требующих либо стеклянного, либо пластикового субстрата для выращивания, а также может быть использована для культивирования других типов нейронов.

Нейроны коры головного мозга крысы, полученные на поздней эмбриональной стадии (E17), наносятся на стеклянные покровные стекла или чашки для культуры тканей, обращенные к питающему слою глии, выращенной на чашках или пластиковых покровных накладках (известных как Thermanox) соответственно. Выбор между двумя конфигурациями зависит от конкретной используемой экспериментальной техники, которая может требовать или не требовать, чтобы нейроны выращивались на стекле (например, визуализация кальция в сравнении с вестерн-блоттингом). Глиальный питательный слой, обогащенная астроглией вторичная культура смешанной глии, получают отдельно из коры новорожденных крысят (P2-4) перед рассечением нейронов.

Основным преимуществом этой системы культивирования по сравнению с культурой только нейронов является поддержка роста, выживания и дифференцировки нейронов, обеспечиваемая трофическими факторами, секретируемыми глиальным фидерным слоем, который более точно напоминает среду мозга in vivo. Кроме того, кокультура может быть использована для изучения нейронально-глиальных взаимодействий¹.

В то же время, загрязнение глии в нейрональном слое предотвращается различными способами (культура низкой плотности, добавление ингибиторов митоза, недостаток сыворотки и использование оптимизированной питательной среды), что приводит к практически чистому нейронному слою, сравнимому с другими установленными методами^1-3. Нейроны могут быть легко отделены от глиального слоя в любое время во время культивирования и использованы для различных экспериментальных приложений, начиная от электрофизиологии⁴, клеточной и молекулярной биологии^5-8, биохимии^5, визуализации и микроскопии^4,6,7,9,10. Первичные нейроны удлиняют аксоны и дендриты, образуя функциональные синапсы¹¹, процесс, который не наблюдается в нейрональных клеточных линиях, хотя некоторые клеточные линии удлиняют эти процессы.

Подробный протокол культивирования нейронов гиппокампа крысы с использованием этой системы совместного культивирования был описан ранее^4,12,13. Здесь мы подробно описываем модифицированный протокол, подходящий для корковых нейронов. Поскольку из каждого эмбриона крысы извлекается примерно 20x10⁶ клеток, этот метод особенно полезен для экспериментов, требующих большого количества нейронов (но не связанных с высокой однородностью популяции нейронов). Подготовка нейронов и глии должна быть спланирована в зависимости от времени. Мы предоставим пошаговый протокол культивирования нейронов коры головного мозга крысы, а также культивирования глиальных клеток для поддержки нейронов.

Protocol

1. Глия Dissection (~ 2 недели до покрытия нейронов)

1. Чтобы подготовиться к месту вскрытия стерильной инструменты в 70% этанола, добавляют 4 мл холодной среды вскрытия до 60 блюд мм (одно блюдо на головной мозг), и место 2,5% трипсина и ДНКазы на льду таять (см. подробную информацию о хирургических инструментов в таблице VI ).
2. Используйте большие ножницы, чтобы обезглавить 2-4 дневных щенков и места головы в 100 мм стерильную чашку.
3. Для использования средне ножницы, чтобы вырезать средней линии через кожу и отступить кожи подвергать черепа. Используйте изогнутые ножницы, чтобы вырезать средней линии и две боковые разрезы через череп, не ....

Discussion

Этот протокол обеспечивает метод культивирования крысы первичных корковых нейронов в присутствии клетки глии, позволяя при этом нейроны, чтобы быть легко выделен экспериментальный анализ. Развитие глии поддержку здорового нейронов фенотипа, а также модулирующих нейронов ответы на экспериментальных процедур в физиологически соответствующим образом. Кроме того, по пассажей первичной глии до культивирования с нейронами этой клеточной популяции становится выборочно обогащенный астроцитов, тем самым предотвращая воспалительн.......