定量的形質転換成長因子（TGF）-β誘導性3次元コラーゲンゲル内侵入を測定するアッセイが記載されている。このアッセイでは、乳がんの開発のさまざまな段階を表現する細胞株のMCF10Aシリーズ、を活用しています。このメソッドは、他の細胞株で使用できるように採用することが可能と侵略の他の潜在的な活性化剤または阻害剤を調査するために使用される可能性があります。
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この記事について
サマリー
要約
TGF -βは、初期段階の腫瘍抑制因子として作用するが、後の段階の1,2で浸潤や転移を刺激することによって、乳がんの進行の役割を反対している。また、TGF -βは、頻繁に乳癌において過剰発現し、その発現は予後不良と転移3,4と相関している。 TGF -β誘導の侵入はよく理解されていないメカニズム。
TGF -βはTGF -βII型（TβRII）とI型（TβRI）受容体を介してその細胞応答を誘発する。 TGF -βによって誘導されるヘテロ複合体形成時には、TβRIIはTβRIをリン酸化する。活性化TβRIはすなわちSmad2およびSmad3、受容性Smad（R - Smadの）をリン酸化することによって、その細胞内の標準的なシグナル伝達経路を開始します。これらの活性化R - Smadは核に蓄積し、標的遺伝子5の転写を調節であるSmad4とヘテロ複合体を形成。以前にDに加えていくつかの他の非のSmadシグナル伝達経路の活性化の傍接したのSmad経路、受容体の活性化の結果は、例えば、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）は6パスウェイ。
乳癌の異なる段階におけるTGF -βの役割を研究するために、我々は、MCF10A細胞システムを利用していました。このシステムは、自発的に不死化MCF10A1（M1）乳房上皮細胞7から構成され、H - RASは、マウス8で前癌病変を生成するM1 -派生MCF10AneoT（M2）、、およびから設立されたM2 -派生MCF10CA1a（M4）を、変換M2異種移植片およびフォーム肺9に転移する能力を持つハイグレードの癌腫。このMCF10Aシリーズは、異なる遺伝的背景によってバイアスされていない悪性の異なるグレードの細胞の応答を研究する可能性を提供しています。
TGF -β誘発性浸潤の分析のために、我々はホモタイプMCF10Aスフェロイド培養細胞のembeを生成試験管内 （図1） における 3次元コラーゲンマトリックスにdded。このようなモデルは、密接に回転楕円体10の内部に外側と静止あるいは壊死細胞上でアクティブと浸潤細胞で、その結果、酸素や栄養素の勾配を確立することによりin vivoでヒトの腫瘍に似ています。回転楕円体ベースのアッセイはまた、単層培養11時薬剤耐性を向上を再現することが示されている。このMCF10 3Dモデルのシステムでは、私たちは悪性腫瘍のさまざまな段階で乳がん細胞の浸潤特性に関するTGF -βシグナル伝達の影響を調査することができました。
プロトコル
1。メトセル溶液（500ml）の準備
- マグネチックスターラーを含む500mlのボトルにメチルセルロースのオートクレーブ6グラム。
- 20分間血清（60℃）なしで予熱DMEM/F12 250ml中にメチルセルロースを溶解する。
- 10％ウマ血清を含むDMEM/F12 250mlの（RT）を追加します。混ぜて一晩（4℃）。
- 遠心分離（5000グラム、2時間、4℃）でソリューションをクリアします。
- 新しいチューブ（ストック溶液の90〜95％程度）に透明な高粘度液を取る。
- 4℃、使用するまでC。
2。スフェロイド培養
- 20パーセントメトセル溶液（10mlメトセル、40 mlの増殖培地）を調製する。
- PBSで細胞を2回洗浄、37℃で0.1％トリプシンとインキュベートセルを追加° C
- 増殖培地中で細胞を再懸濁し、細胞を数えます。
- 20％メトセルにmlあたり10 000細胞の懸濁液を準備します。
- 96ウェル丸底のために細胞懸濁液を追加します。uspensionプレート（ウェルあたり100μl）。
- 翌日、サスペンションプレートの回転楕円体の形成を確認してください。スフェロイドは1-3日後に使用できるようになります。
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ディスカッション
我々はMCF10A1細胞とその悪性誘導体はTGF -β依存的にコラーゲンマトリックス内に侵入した回転楕円体モデルを確立した。最初に、スフェロイドは、メチルセルロースの存在下で96ウェル丸底サスペンションプレートに形成されています。もちろん、またU字型のポリ- HEMAコートしたプレートは、この目的のために使用することができます。細胞はメチルセルロースのない状態で死んでしまうので、メチルセルロースは、絶対に、このステップが必要です。我々は細胞がこの因子はコラーゲンの培地オペアンプの上部に追加されたときにTGF -βにあまりよく応答することがわかったので、TGF -βはコラーゲン-メトセル混合物に直接追加されます。 DMSOはicecoldコラーゲンメトセルの混合物に沈殿物しかし、それは、コラーゲンに直接ではなくDMSOに溶解した化学物質の阻害剤を添加することをお勧めします。したがって、我々は、コラーゲンの上に培地中でこれらの化合物を加える。
その後、細胞はコラーゲン3 dimensに埋め込まれているそれらはコラーゲンマトリックスに侵入できるようにional環境。異なるMCF10A1細.......
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謝辞
我々は、細胞株のための試薬とフレッドMillerのケン岩田（OSIファーマシューティカルズ、ニューヨーク、アメリカ）（バーバラアンカルマノスがんIntitute、デトロイト、米国）に感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント（省略可能） |
| メチルセルロース | シグマアルドリッチ | M0512 | |
| PureCol | 高度なニッピ | 5005 - B | |
| pH指示薬のストリップ | メルク | 9533 | |
| 96ウェルサスペンション プレート | グライナーバイオワン | 650 185 | |
| TC接着96ウェル プレート | グライナーバイオワン | 655 180 |
参考文献
- Akhurst, R. J., Derynck, R. TGF-β signaling in cancer--a double-edged sword. Trends. Cell. Biol. 11, S44-S51 (2001).
- Massagué, J. TGF-β in Cancer. Cell. 134, 215-215 (2008).
- Ghellal, A.
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