Summary
وصفا للتحريض الجراحي للبطانة الرحم في الفئران والجرذان التي زرع السيارات من نسيج الرحم إلى تتالي الشرايين من مساريق المعوية.
Abstract
بطانة الرحم هو المزمنة ، والأمراض المؤلمة التي المسببات ما زال مجهولا. وعلاوة على ذلك ، يمكن علاج بطانة الرحم بالمنظار تتطلب إزالة الآفات ، و / أو إدارة الأدوية المزمنة من أعراض الألم والعقم. وقد قدرت التكاليف المرتبطة بطانة الرحم عند 22 مليار دولار سنويا في الولايات المتحدة 1. لمزيد من فهمنا للآليات الكامنة وراء هذا المرض الغامض ، وقد استخدمت النماذج الحيوانية. قرود تطوير عفويا بطانة الرحم وبالتالي معظم النماذج الرئيسيات شبها المرض لدى النساء. نماذج القوارض ، ومع ذلك ، هي أكثر فعالية من حيث التكلفة ومتاحة بسهولة 2. النموذج الذي وصفنا هنا ينطوي على نقل ذاتي للأنسجة الرحم إلى مساريق المعوية (الشكل 1) ، وكان أول من طور في الفئران (3) ونقل لاحقا الى 4 الماوس. الهدف من طراز القوارض ذاتي من بطانة الرحم جراحيا المحرض هو تقليدالمرض لدى النساء. لقد أظهرنا وغيرهم في وقت سابق ان تغيير نمط التعبير الجيني لوحظت في الانتباذ البطاني الرحمي الآفات من الفئران او الجرذان التي المرايا التي لوحظت في النساء المصابات بهذا المرض 5،6. ميزة واحدة لتنفيذ عملية جراحية في الماوس هو أن وفرة من سلالات الماوس المعدلة وراثيا يمكن أن تساعد الباحثين المتاحة في تحديد دور مكونات محددة مهمة في تأسيس ونمو بطانة الرحم. هو أيضا نموذج بديل التي يتم فيها إدخال يستأصل الرحم شظايا الإنسان إلى البريتوني من الفئران المناعة المستخدمة على نطاق واسع ولكن محدود بسبب عدم وجود نظام المناعة الطبيعية التي يعتقد أن تكون مهمة في بطانة الرحم 2،7. الأهم من ذلك ، في نموذج الفأر من بطانة الرحم الناجم جراحيا هو نموذج متعدد الاستعمالات التي استخدمت لدراسة كيفية عمل الجهاز المناعي 8 ، 9،10 الهرمونات والعوامل البيئية تؤثر على بطانة الرحم 11،12 فضلا عن تأثيرات على بطانة الرحم فيرility 13 و 14 الألم.
Protocol
1. التخطيط للجراحة الحيوانات الحية
- تأكد من أنه تم الحصول على موافقة الملائمة للعمل مع الحيوانات المختبرية.
- الفئران النظام والسماح على الأقل أسبوع واحد من التأقلم مع بيئتهم الجديدة.
- يشار ظاهرة إناث الفئران الموجودة في غياب التعرض للالفيرومونات الذكور يمكن أن يوقف الدراجات وذلك ليتون كما أثر 15،16. للحفاظ على الفئران الدراجات نقل البول غارقة في الفراش الذكور إلى الإناث في قفص كل خمسة أيام. بدلا من ذلك ، إذا تم استخدام أقفاص مكشوفة ، ومكان القفص الإناث بين اثنين من أقفاص من الذكور الإناث للحفاظ على ركوب الدراجات بشكل منتظم.
- تأكد من أن الفئران هي ركوب الدراجات من خلال تحليل الخلايا المهبلية يوميا لمدة أسبوع على الأقل قبل الجراحة (الجدول 1) 17.
- استخدام قلم الشمع لإنشاء أقسام eight على شريحة زجاجية بحيث يمكن جمع مسحات مهبلية من الفئران متعددة.
- مسح المهبل مع المالحة ،2-0،25 العادي مل من الماء المقطر أو باستخدام شافطة. يمكن لياليويمكن لدى عودتهم إلى مكان الشافطة فقط على فوهة المهبل ، وتحفيز عنق الرحم مع الشافطة يسبب حمل كاذب. مكان غسل المهبل على الشريحة الزجاجية لتحليل أنواع الخلايا. يمكن قراءة الشرائح الطازجة (الرطب) أو ثابتة بدلا من عدد من الأساليب ودرست باستخدام مجهر ضوء معيار 17.
- جمع وتنظيف وتعقيم جميع المعدات اللازمة لعملية جراحية لجراحة ناجحة العقيم (انظر قسم المواد) 18.
- يعد حل لتسكين البوبرينورفين في برنامج تلفزيوني باستخدام تقنية معقمة لتسليم 0.2 ملغ / كلغ جرعة النهائية. وينبغي تركيز الحل البوبرينورفين يكون 0.0333 ملغ / مل على افتراض أن متوسط C57BL الكبار / 6 الماوس يزن حوالي 0،025 كيلوغرام وحجم حقن تحت الجلد من 0.15 مل في الماوس. يمكن تحضير البوبرينورفين قبل الموعد المحدد وتخزينها كما aliquots. علما بأن البوبرينورفين هو عبارة عن مادة الجدول الثالث للرقابة التي تتطلب ترخيصا ومفصلة DEA سجل المخزون.
- إعداد برنامج تلفزيوني العقيمة مع البنسلين (100 U / مل) ، وستربتوميسين (100 ميكروغرام / مل).
- مزامنة دورات شبق عن طريق نقل البول غارقة في الفراش الذكور إلى الإناث 72 ساعة في الأقفاص قبل الاستقراء 15.
2. اعداد منطقة الجراحية للجراحة الحيوانات الحية
- اعداد منطقة العمليات الجراحية كما هو موضح سابقا 18.
- اعداد منطقة التحضير التي تحدد كليبرز الكهربائية ، ومرهم للعين ، والدعك الجراحية.
- اعداد منطقة العمليات الجراحية عن طريق وضع إعادة تدوير المياه الساخنة للتدفئة وسادة على منطقة العمليات الجراحية للحفاظ على درجة حرارة الجسم خلال الجراحة. وضع وسادة معقمة للماء خلال إعادة تدوير المياه الساخنة وسادة التدفئة. ترتيب الأدوات الجراحية ، خياطة ، طبق بتري معقمة الزجاج ، لكمة خزعة ، شاش معقم ، ومقاطع الجرح والجرح قضيب مقطع على الحقل الجراحية المعقمة.
- تعد منطقة الانتعاش من خلال وضع إعادة تدوير المياه الساخنة للتدفئة منصات اوند في منتصف الطريقإيه قفص الفئران فارغة للسماح للتحرك بعيدا عن الحرارة إذا رغبت في ذلك.
3. تخدير وإعداد الماوس لعملية جراحية
- سجل وزن الماوس ، وتحديد المرحلة التي شبق تقييم الخلايا المهبلية.
- لتحريض التخدير ، ضع الماوس في غرفة التخدير فارغة (قفص فارغ مع غطاء الصلبة التي تحتوي على بوابة لisoflurane). بدوره على نظام isoflurane مخدر غير إعادة التنفس وتعيين المرذاذ إلى 4 ٪ isoflurane (مع معدل تدفق الأوكسجين من 0.5 إلى 1 لتر / دقيقة).
- عند الفأر هو تحت التخدير التبديل تدفق isoflurane لمخروط (30-60 غمد حقنة مل) ، والماوس مكان الأنف والفم في المخروط على طاولة التحضير. يمكن الحفاظ على التخدير الكافي مع انخفاض تركيز isoflurane طوال الفترة المتبقية من عملية جراحية (~ 2،5-3،5 ٪ isoflurane). وينبغي تحديد عمق كاف من التخدير بواسطة استجابة سلبية لتحفيز قرصة أخمص قدميه.
- ر تطبيق مرهم للعينس تجنب جفاف العينين أثناء الجراحة.
- استخدام كليبرز الكهربائية الصغيرة ، ويحلق في موقع الجراحة.
- تطهير وإعداد الموقع لعملية جراحية مع ثلاثة من الضربات الشديدة بالتناوب فرك الكلورهيكسيدين والايثانول 70 ٪.
- ثنى الحيوانية مع حقل معقمة.
4. ربط الرحم
- جعل صغيرة (~ 1 سم) شق خط الوسط سواء باستخدام مقص أو شفرة صغيرة مشرط المنتهية 0،5-1،0 سم منقاري إلى الفتحة المهبلية.
- إدراج مقص مغلقة في الافتتاح ان هذه الشفرات ما بين جدار الجسم وجدار البطن. تشريح حادة بلطف المنطقة المحيطة شق طريق فتح ببطء وإغلاق المقص بحيث يتم فصل جدار البطن بما فيه الكفاية من الجلد. يمكن التصاقات مرئية المتبقية بين جدار البطن والجلد حول موقع شق مقصوص بعناية. وفشل لفظة كاف تشريح موقع شق جعل إغلاق جدار البطن أكثر صعوبة.
- به و الصغيرةorceps ، موقع بلطف القرن ترك الرحم. الرحم هو الظهرية إلى الأمعاء ، وهو ما سوف ترى عند الدخول لأول مرة موقع شق. في بعض الحالات يكون من الأسهل لتحديد أول المبيض والمبيض وسادة من الدهون المرتبطة بها. برفق حتى على قرن الرحم والشريحة an ملقط فتح تحتها لتكون بمثابة ضام. إذا رغبت في ذلك ، لاحظ ظهور المبيض والرحم في هذا الوقت للحصول على معلومات إضافية بشأن المرحلة شبق عند التحريض (الجدول 1).
- الشريحة بلطف قطعتين من الطول 6-8 5-0 سوداء خياطة الحرير مضفر (بدون إبرة) تحت الهورن امتدت الرحم.
- ligate آمن قرن على مفترق الطرق ، tubual الرحم (الذيلية لمجرد قناة فالوب) وعند تقاطع الرحم ، عنق الرحم (منقاري عادل لعنق الرحم) باستخدام عقدة مربع في كل موقع. ترك طرفي الخيط لحظة.
- قطع الفرع من قرن الرحم عملية ربط بين البلدين ووضع الأنسجة في العقيمة الزجاج CONTA طبق بتريining ~ 100 ميكروليتر من PBS تحتوي على البنسلين (100 U / مل) ، وستربتوميسين (100 ميكروغرام / مل). قطع طرفي الخيط الحرير الماضي. إذا خياطة تأتي فضفاضة أو وجود نزيف ، والعثور على الجذع وربطة عنق عقدة أخرى.
5. تعد عملية زرع الرحم يستأصل من الانتباذ البطاني الرحمي
- في حين يجري التلاعب يستأصل الرحم ، وتغطية البطن مع شاش معقم والحفاظ على الماء المعقم مع البنسلين والتي تحتوي على برنامج تلفزيوني الستربتوميسين حسب الحاجة.
- الشريط القرن يستأصل الرحم من الدهون.
- إذا رغبت في ذلك ، ويزن القرن يستأصل الرحم.
- فتح بوق الرحم عن طريق إدخال شفرة واحدة من مقص صغير (14 مم طول النصل) في التجويف والانزلاق إلى أسفل برفق مقص قرن الرحم في حين عقد القرن بالملقط.
- في صحن بيتري الزجاج ، واستخدام 2 ملم خزعة لكمة الى خفض الى ثلاثة يزرع الحجم متساوية.
6. خياطة يزرع الانتباذ البطاني الرحمي في التجويف البريتوني
- مكان sterilالشاش ه مباشرة فوق موقع شق ورطبة تماما مع برنامج تلفزيوني العقيمة التي تحتوي على البنسلين والستربتومايسين.
- مع الصغيرة ، وملقط السلس تجد بلطف الأعور والتحرك rostrally طول الأمعاء الدقيقة. سحب صغيرة (4-5 سم) مقطع من الأمعاء أن اثنين على الأقل بعيدا عن الشرايين الأعور وترتب عليه مثل مروحة على الشاش المبللة مسبقا بحيث تتالي الشرايين من مساريق المعوية مرئيا بوضوح. تأكد للحفاظ على رطوبة الأمعاء في جميع الأوقات مع ملحي معقم. ملاحظة : لا تستخدم الجرذان ملقط مسنن أثناء التعامل مع الأمعاء.
- 6-0 استخدام الخيط الأسود مع ethilon P - 1 11 ملم ، 3 / 8 الدائرة ، عكس قطع الإبرة لخياطة بلطف one زرع الشريان إلى حوالي 0.5 سم من الامعاء.
- ملاحظة : يتم تغطية مساريق الأمعاء بطبقة رقيقة من الغشاء البريتوني. كن حذرا لجعل تمريرة النظيفة من خلال هذه الطبقة ، بينما خياطة حول الشريان. سحب الخيط من خلال ببطء وبحذر حتى لا تمزق الغشاء البريتوني أو تمزقالشريان.
- استكمال دورتين عقدة واحدة رمي كل منهما ، والحرص على عدم تشديد خياطة من الصعب جدا ، لأن ذلك قد يؤدي إلى فقدان تدفق الدم ونخر لاحقة من الأمعاء والموت. تقليم خياطة داخل 2 ملم من الزرع. الرطب الأمعاء مرة أخرى لمواصلة للحفاظ على الماء قبل أن ينتقل إلى زرع المقبل.
- تتحرك في اتجاه منقاري ، سحب الطول المقبل 04/03 من الأمعاء واستبدالها بلطف المقطع الذي يحتوي بالفعل على الزرع. تخطي واحد أو اثنين من الشرايين في موقع الزرع السابقة وخياطة الزرع المقبل. كرر لزرع الثالث.
- استبدال كل من الأمعاء في تجويف البطن.
7. جراحات الشام
- وتجرى العمليات الجراحية الزائفة باستخدام نفس الخطوات والعمليات الجراحية بطانة الرحم عدا أنه يتم تخييط النسيج لا لمساريق المعوية.
- استئصال الرحم والبوق اليسرى في الخطوة 4.
- ليسوا على استعداد يزرع الانتباذ البطاني الرحمي (الخطوة 5) في جراحة صورية. ويمكن التخلص منها قرن الرحم يستأصل أو استخدامها لأغراض أخرى إذا رغبت في ذلك.
- وتوضع الخيوط الجراحية ، ولكن لا الأنسجة ، حول ثلاثة شرايين في تتالي الشرايين من مساريق الأمعاء كما هو الحال في الخطوة 6.
8. إغلاق الجروح
- التأكد من أن جميع الأجهزة تقريبا تعود الى مواقعها التشريحية.
- استخدام 5-0 خياطة vicryl المغلفة في غرزة غير المتشابكة المستمر لإغلاق جدار البطن.
- 9 استخدام مقاطع ملم لإغلاق الجرح الجلد.
9. استرداد الحيوان
- إدارة 0،33 ملغ / مل في البوبرينورفين 0.15 الماوس ز ml/25 عن طريق الحقن تحت الجلد لجرعة من 0.2 ملغ / كلغ. يدار البوبرينورفين بعد العملية لمنع المزيد من الاكتئاب القلب والأوعية الدموية / الجهاز التنفسي التي يمكن أن يطيل عملية الاسترداد.
- الجافة بلطف الفأر مع kimwipes أو المناشف الورقية اذا حصلت الرطب أثناء الجراحة.
- مكان الجانب الحيواني في بطني أسفل القفص عartially على قمة منصة إعادة تدوير المياه الساخنة حتى يتم انتشال الحيوان واستعاد الاستلقاء القصية (في غضون خمس دقائق كما نشوق مخدر ترتدي بسرعة إيقاف).
10. الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية
- ينبغي التقيد الفئران كل 15 دقيقة حتى يتمكنوا من الحفاظ على الاستلقاء القصية ، ثم ساعة حتى يستعيد سلوكهم بشكل طبيعي بعد الجراحة.
- وينبغي أن الفئران تبدو طبيعية في غضون 24 ساعة من الجراحة. وينبغي رصد الفئران يوميا لمدة سبعة إلى عشرة أيام بحثا عن علامات على الانتعاش وصحة جيدة.
- مؤشرات تدل على أن الحيوان هو في حالة صحية سيئة ، والألم ، أو الاستغاثة تشمل انخفاض النشاط ، تشويه الذات ، والمظهر ungroomed ، أو التقوس في الجلوس.
- إذا كان الحيوان لا تبدو في صحة جيدة في غضون 24 ساعة من الجراحة ، وإما إدارة البوبرينورفين (0.2 ملغ / كلغ) أو الموت ببطء الحيوان. إذا كان هذا الحيوان لم يتحسن في غضون 8 ساعات من البوبرينورفين التكميلي الادارة شول الحيوانيةد كما يتم التخلص من المرجح نخر الأمعاء.
- إزالة مقاطع الجرح 7-10 أيام بعد الاستقراء.
- تواصل رصد دوروية شبق عن طريق الفحص المهبلي من الخلايا لمدة التجربة. مزامنة دورات شبق قبل 72 ساعة لجمع البول عن طريق نقل غارقة في الفراش الذكور إلى الإناث في أقفاص كما هو موضح في الخطوة 1.3.
11. التشريح والأنسجة الختان
- توقيت التشريح يتوقف على مسألة بحثية معينة ويتم مواصلة مناقشة نتائج ممثلة في والمناقشة.
- الموت ببطء الماوس خنقا غاز ثاني أكسيد الكربون.
- جمع الدم عن طريق ثقب القلب باستخدام إبرة قياس 23 على حقنة 1cc (إذا رغبت).
- جمع مسحة مهبلية علم الخلايا على النحو المبين أعلاه لتحديد مرحلة الشياع في وقت لجمع 17.
- قطع قرن الرحم المتبقية في الرحم ، وعند مفترق الأنبوبي عنق الرحم ، وإزالة الدهون ، ووزن ، والعمليةالمطلوب (انظر 11.14 و11.15).
- تحديد الخيوط السوداء حول الآفات الانتباذ البطاني الرحمي. صورة سليمة الآفات الانتباذ البطاني الرحمي اذا شئت.
- تشريح بعناية الالتصاقات المحيطة الآفات الانتباذ البطاني الرحمي مع مقص صغير وملقط ، والحرص على عدم الآفات لانس. العمل بسرعة وبدقة لمنع تدهور الحمض النووي الريبي.
- وسجل قياس طول وعرض للآفات الانتباذ البطاني الرحمي باستخدام الفرجار.
- استئصال الآفات الانتباذ البطاني الرحمي ترطيبها وتوضع على منشفة ورقية مع برنامج تلفزيوني. إزالة أي نوع من الأنسجة غير الانتباذ البطاني الرحمي من الآفات. ويمكن استخدام الزجاج مجهر أو مكبرة تشريح الوقوف للمساعدة في تشريح.
- وزن السائل الآفات الثلاث الانتباذ البطاني الرحمي شغلها قبل إزالة خياطة.
- إزالة الخيط بلطف من الآفات الانتباذ البطاني الرحمي.
- للعلم الأنسجة ، وإصلاح الفورمالين one السوائل تملأ الآفة الانتباذ البطاني الرحمي لمدة ساعتين تليها ثلاث thirty يغسل PBS الدقيقة والتخزين النهائي طن الايثانول 70 ٪. تضمين يذوى والبارافين.
- انس اثنين من الآفات الانتباذ البطاني الرحمي. تزن هذه مرة أخرى. منذ التغيرات الهرمونية الدورية يمكن أن يغير من كمية السوائل كيسة ، وهذا يعطي قدرا من الوزن الرطب الأنسجة بالإضافة إلى وزن زائد الكيس السائل كما تقاس في 11.10.
- لعزل الحمض النووي الريبي ودراسات التعبير الجيني ، التجانس على الفور واحدة من الآفات والانتباذ البطاني الرحمي lanced (أو أنسجة الرحم ~ 20 ميكروغرام) في محلول تحلل ملزمة وتخزينها في -80 درجة مئوية لمدة عزل الحمض النووي الريبي في المستقبل مع مجموعة RNAqueous (Ambion) أو طريقة أخرى المرجوة.
- العزلة عن مستقبل RNA ، DNA ، أو البروتين ، وعلى الفور تجميد الإضافية الثانية الآفة lanced الانتباذ البطاني الرحمي (~ 20 ميكروغرام أو أنسجة الرحم) في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية.
ممثل النتائج
الآفات الانتباذ البطاني الرحمي في نموذج الفأر من بطانة الرحم الناجم جراحيا شكليا وتشريحيا تشبه تلك التي لوحظت فيالمرأة. التحليل النسيجي للبطانة الرحم في كل من المرأة والفأر نموذج يشير إلى أن الآفات الانتباذ البطاني الرحمي تحتوي على بطانة الرحم والغدد سدى (الشكل 2A). الآفات الانتباذ البطاني الرحمي في الفئران تحتوي أيضا على هيموسيديرين محملة الضامة ، والتي هي سمة مشتركة من بطانة الرحم في النساء (الشكل 2B) 19.
الانتباذ البطاني الرحمي إزالة الآفات من الفئران بعد ثلاثة أيام من تحريض ملتهبة ويبدو النزفية (الشكل 3A). بعد 2-4 أسابيع من الآفات النمو الانتباذ البطاني الرحمي في نموذج الفأر وكيسة تشبه السوائل المعبأة ومحاطة التصاقات البريتوني (أرقام 3B و 3C). مقارنة الوزن الآفة في التحريض ، وكان السائل الآفات شغل 306 ٪ و 862 ٪ أكبر دفعة واحدة وشهرين بعد الاستقراء والآفات lanced كانت 51 ٪ وأكبر 172 ٪ ، على التوالي (أرقام 4A و 4B). لقد حصلنا على السائل بما يتفق وملأت lanced الأوزان الآفة الانتباذ البطاني الرحمي في شهر واحد بعد تحريض على مدى خمس تجارب مختلفة (الشكل 5). في شهر واحد آخر فيالسوائل تملأ شوس (7.44 ± 3.75 ملغ) ، وكانت مرتبطة بشكل كبير lanced (2.92 ± 1.23 ملغ) الوزن الآفة الانتباذ البطاني الرحمي (معامل ارتباط بيرسون = 0.669 ، P <0.001).
ولم سن الماوس لا تؤثر على حجم الآفة بالنسبة للفئران تتراوح بين ثلاثة أشهر وعشرة من العمر. لا السائل شغلها أو الانتباذ البطاني الرحمي lanced الوزن الآفة في شهر واحد ارتبط بشكل ملحوظ بعد الاستقراء مع عمر الحيوان (ص = -0.136 ، P = 0.380 -0.063 و r = ، ع = 0.698 على التوالي).
الرحم الماوس يخضع لتغيرات في حجم واحتباس السوائل ، وانتشار الخلايا وظهور نتيجة لتأثير هرمونات الستيرويد خلال دورة شبق. قارنا وزن الآفة الانتباذ البطاني الرحمي لوزن القرن المتبقية الرحم سليمة من الحيوانات في مراحل مختلفة شبق. لم نجد ارتباط كبير بين الوزن الرحم والسائل ملؤها ، أو ل الانتباذ البطاني الرحمي lancedesion الوزن في شهر واحد آخر التعريفي (ص = -0.046 ، P = 0.765 و 0.232 = ص ، ع = 0.155 على التوالي).
نمط التعبير الجيني لوحظت في الانتباذ البطاني الرحمي الآفات من الفئران التي أبلغت عن كثب المرايا في نساء مع المرض 5. قبل ثلاثة أيام بعد تحريض الجينات التي تنظم خارج الخلية إعادة تشكيل المصفوفة ، التصاق الخلايا والأوعية الدموية هي upregulated للغاية وكثير من هذه الجينات تظل upregulated خلال شهر واحد من النمو.
الأرقام والجداول
الشكل 1. تحريض بطانة الرحم بواسطة الجراحي للأنسجة الرحم autologus نقل في الماوس. هو ligated القرن غادر الرحم ، ورفعه ، وفتحت طوليا لفضح بطانة الرحم. يتم إعداد ثلاث الخزعات 2 مم 2 وتخاط إلى كل شريان في سلسلة من mesente الشرايين المعويةراي. قبل شهر واحد بعد تحريض للآفات الانتباذ البطاني الرحمي والسوائل المعبأة ومحاطة الالتصاقات.
الشكل 2 الهيماتوكسيلين ويوزين القسم الملون من بطانة الرحم من آفة الفأر نموذج من بطانة الرحم في شهر واحد بعد تحريض التظاهر (أ) وجود بطانة الرحم والغدد سدى ؛ بار النطاق = 50 ميكرومتر و (ب) الضامة هيموسيديرين لادن ، يشار إلى بعض السهام التي كتبها ؛ شريط النطاق = 20 ميكرون.
الشكل 3. الآفات الانتباذ البطاني الرحمي في نموذج الفأر التالية القتل الرحيم ، إما ثلاثة أيام بعد الاستقراء (A) أو شهر واحد بعد الاستقراء (B و C).
الشكل 4. الآفات الانتباذ البطاني الرحمي من الفئران التي يسببها جراحيا لENتم رفعه dometriosis وزنه في شهر أو شهرين بعد الاستقراء. البيانات المتوسط ± SEM. وسجل تحويل البيانات ورسائل مختلفة تشير إلى أهمية داخل كل لوحة من قبل في اتجاه واحد أنوفا تليها واحدة على الأقل من جانب فيشر كبير مقارنات Mulitple الفرق. (A) مثل الكيس ، والآفات السوائل تملأ الانتباذ البطاني الرحمي (N = 10 أو 7 أو 5 لتحريض ، شهر واحد ، أو شهرين بعد الحث على التوالي). (ب) الآفات Lanced الانتباذ البطاني الرحمي (N = 10 ، 8 أو 7 لتحريض ، شهر واحد أو اثنين في الشهر بعد الحث على التوالي).
الشكل 5. الانتباذ البطاني الرحمي الوزن الرطب آفة مع السوائل وlanced في شهر واحد بعد تحريض من خمس تجارب منفصلة. البيانات المتوسط ± SEM. الفئران N = 10 ، 6 ، 7 و 8 و 7 للآفات السوائل المعبأة و0 7 ، 10 ، 8 ، و 8 للآفات lanced في تجربة 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، و 5 على التوالي.
الجدول 1. مراقبة المرحلة شبق بواسطة علم الخلايا المهبلية والمظهر المرئي للالمبيض والرحم والاستقراء.
سوف مظهر المبيض والرحم يكون الوقت قد حان التابعة. وتستند التالية على التضحية في جميع أنحاء 8:00 من صباح كل يوم دورة. مزيد من الملاحظات وموضوعية ومقارنة المبيض والرحم قرون سيكون أفضل تقدير من قرون الرحم فقط. وتهدف هذه الملاحظات لاستكمال المعلومات التي تم الحصول عليها من قراءات يومية الخلايا المهبلية.
الجدول 2. مقارنة لعملية جراحية في الماوس والفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك العديد من البارامترات الحاسمة التي ينبغي أن تكون لاحظت أثناء تنفيذ العمليات الجراحية في تحريض بطانة الرحم في الفئران. الأول ، هو مرض بطانة الرحم هرمون الاستروجين والتي تعتمد على الجراحة مثل هذا ينبغي أن يقوم على الحيوانات سليمة أو بدلا من ذلك في الحيوانات ovariectomized تستكمل مع هرمون الاستروجين 20. ثانيا ، يجب على الخزعات خياطة بطانة الشرايين لتتالي أن يؤديها مع الحذر الشديد. لقد وجدنا أن استخدام اثنين فقط من عقدة فضفاض نسبيا مع واحد رمي كل يحافظ على خزعة في المكان في حين منع الربط من وصول الدم الى الامعاء واللاحقة نخر الأنسجة وموت الحيوان. نحن نوصي بشدة ممارسة عدة على الفئران قبل التجربة الفعلية لضمان أن يتم وضع آمن بما فيه الكفاية الغرز لا تضيع والأنسجة ، ولكن ليس ضيق جدا من شأنها أن تسبب تنخر في الامعاء. ثالثا ، من المهم جدا للحفاظ على نسيج الأمعاء رطب مع البنسلين العقيمة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني وخلال ليالي الستربتوميسينurgery. وينبغي اتخاذ الرابعة والجهود الرامية إلى ضمان أن الانتباذ البطاني الرحمي حجم الزرع هو ثابت. لهذا الغرض نستخدم مم 2 خزعة لكمة لخلق يزرع الانتباذ البطاني الرحمي الحجم على نحو متسق من أنسجة الرحم استئصاله.
هناك العديد من التعديلات التي يمكن إجراؤها على هذا البروتوكول لتلائم الاحتياجات الفردية والمسائل العلمية للباحث. واحد يخص تعديل محتمل لملف الهرمونية للحيوان. قد تكون الجينات والبروتينات في التعبير الآفات الانتباذ البطاني الرحمي ، وتبقى على حالها قرن الرحم والجهاز المناعي يتأثر مباشرة من قبل توقيت جمع في ما يتعلق مرحلة دورة شبق. هناك عدة طرق للتحكم للمرحلة الشياع في ذلك الوقت لجمع ، ولكل منها مزاياه وعيوبه. على سبيل المثال ، يمكن مزامنة سليمة الحيوانات ركوب الدراجات ، وذلك بتحويل البول غارقة في الفراش الذكور الإناث في قفص لمدة ثلاثة أيام قبل أن تحريض أو جمع هذه الحيوانات هي جراحيا ايندودائرة الهندسة المدنية والتي تم جمعها خلال المرحلة شبق نفسه 15. إذا تم استخدام الدراجات الحيوانات سليمة ، ينبغي رصد شبق دوروية يوميا فحص الخلايا المهبلية 17. هذا وقد تتميز بأنها أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية ، ولكن تحقيق التزامن دورة غير ناجحة 100 ٪. بدلا من ذلك ، يمكن مزامنة حيوانات سليمة من قبل الادارة 21،22 الخارجية موجهة الغدد التناسلية. في حين أن أكثر دقة بعض الشيء ، وهذا الأسلوب يخلق مستويات أعلى من هرمون الاستروجين أكثر من المعتاد. وقد نهج آخر لovariectomize الحيوانات والعطاء على مستوى ثابت من الهرمونات الخارجية سواء من خلال كبسولة silastic ، ومضخة صغيرة التناضحي ، أو الحقن اليومية 4،8. هذا الأسلوب له ميزة الحصول على لمحة هرمون موحدة عبر العديد من الحيوانات ، ولكن ليست مفيدة لأن الحيوانات لا ركوب الدراجات.
يمكن إجراء العمليات الجراحية الزائفة لتقييم الآثار التي هي نتيجة لخضوعه لعملية جراحية في مقابل الآثار attributabلو لبطانة الرحم. في جراحات صورية تتم إزالة الرحم والبوق اليسار توضع الخيوط حول الشرايين في الشرايين سلسلة من مساريق المعوية ولكن لا تتم خياطة يزرع 5،8،23 الانتباذ البطاني الرحمي. بدلا من ذلك ، يمكن إزالة الدهون خياطة من قرن الرحم رفعه إلى 3،14 مساريق المعوية. كنا قد ذكرت مؤخرا ان هناك اختلافات قليلة نسبيا في التعبير الجيني مقاسا [كدنا] [ميكروأري الرحم بين الشام وسليمة قرن الرحم المتبقية من الحيوانات التي يسببها جراحيا لبطانة الرحم 5. وعلاوة على ذلك ، وذلك باستخدام كمية PCR الوقت الحقيقي للجينات بطانة الرحم المتصلة السبعة ، وجدنا أن التعبير فقط هابتوغلوبين كان مختلفا بشكل كبير في الرحم وبطانة الرحم صورية والفئران. لي وآخرون. ومع ذلك ، أبلغ تعبير عن الفرق الخمسة الجينات في الرحم من الفئران التي يسببها لبطانة الرحم مقارنة مع الضوابط الشام 23. هذا يشير إلى أن وجود lesio الانتباذ البطاني الرحمييمكن أن يسبب تغير نانوثانية التعبير الجيني في الرحم سوي التوضع.
ينبغي تحديد توقيت جمع من الفئران التي يسببها لبطانة الرحم جراحيا قبل السؤال البحثي معينة. مجموعة من الفئران بعد ثلاثة أيام من تحريض يسمح احد لتقييم الحرجة ، والأحداث في وقت مبكر من إنشاء بطانة الرحم بما فيها العدلات الأولية وتسلل machrophage والإنتاج خلوى كما ذكرت سابقا 8. لقد أظهرنا بأن الآفات التي جمعت الانتباذ البطاني الرحمي ثلاثة أيام بعد تحريض صغيرة ، وعزى ، وغيرت كثيرا التعبير الجيني بالنسبة للقرن الرحم 4 المتبقية. قبل أسبوعين هي راسخة بعد تحريض الآفات الانتباذ البطاني الرحمي ، وشكلت في كثير من الأحيان كيسة مثل الهياكل. في الماوس ، والآفات الانتباذ البطاني الرحمي تستمر الزيادة في الحجم ، وفقا لتقييم وزن السائل معبأ وlanced الآفات (الشكل 4) ، فضلا عن حجم الآفة التي يحددها العرض والطول وheigحزب التحرير من خلال قياسات شهرين بعد تحريض 9.
كما ذكر أعلاه ، وضعت أول نموذج العمليات الجراحية في بطانة الرحم في الفئران ومازال يستخدم على نطاق واسع 3. عند إجراء هذه الجراحة في الفئران نحن إجراء التعديلات التالية على البروتوكول ، على النحو الموجز في الجدول 2. في الفئران ، كل من الغرز المستخدمة هي حجم 4-0 و يمكن وينبغي أن تكون مرتبطة على نحو أكثر إحكاما. بالإضافة إلى ذلك ، فإننا خياطة six 5 مم 2 يزرع الانتباذ البطاني الرحمي في مساريق المعوية من التجويف البريتوني.
في هذا البروتوكول وصفنا استخدام مخدر استنشاقها ، isoflurane. بدلا من ذلك ، حقن مخدر مجتمعة تتألف من الكيتامين وDomitor (medetomidine هيدروكلوريد) أو يمكن استخدام آخر ألفا ناهض - 2 ، على الرغم من الانتعاش مرة أطول بعض الشيء. الكيتامين ، وتدار على 75 ملغ / كلغ عن طريق الحقن intraperiotneal ، هو عامل مخدر فصامي مع الحد الأدنى من تخفيف الألم الحاد خصائصالثاني هو الجدول الثالث المخدرات تتطلب ترخيصا DEA ومفصلة جرد المخدرات. Domitor ، وتدار في 1 ملغ / كلغ ، هو ناهض الأدرينالية ألفا 2 ويتم عكس بسهولة مع الادارة (atipamezole هيدروكلوريد) Antisedan. Domitor هو المسكنات التي توفر استرخاء العضلات وتخفيف الآلام. يمكن تحضير Domitor والكيتامين قبل الموعد المحدد في برنامج تلفزيوني في تركيبة باستخدام تقنية معقمة. يمكن تحضير Antisedan ، وكيل لعكس Domitor ، في برنامج تلفزيوني في تركيبة مع البوبرينورفين وينبغي أن تدار في 1 ملغ / كلغ بعد العملية. البوبرينورفين أيضا الجدول الثالث المخدرات وتشمل البدائل غير الستيرويدية المضادة للالتهابات banamine (فلونيكسين meglumine) وكيتوبروفين.
كما هو الحال مع جميع الموديلات هناك بعض القيود المرتبطة الجراحية للتحريض بطانة الرحم لدى القوارض. هو قبل كل شيء أن القوارض لم يكن لديك الدورة الشهرية ، وبالتالي لا تتطور تلقائيا بطانة الرحم. في محاولة لجعل وزارة الدفاع القوارضأكثر تشابها من الناحية الفسيولوجية للحالة في البشر بعض الباحثين اختاروا لحقن ذاتي أو أنسجة الرحم مثلي شظايا من الحيوانات syngenic في التجويف البريتوني مباشرة دون خياطة 24،25 ش. في الفئران ، وحقن الأنسجة كيسة أشكال تشبه الآفات الانتباذ البطاني الرحمي ، إلا أن أسلوب الحقن تحريض لا يبدو أن العمل في الفئران والنسيج ونعلق فشل غزو في التجويف البريتوني 3.
لقد كان النموذج القوارض المستخدمة على نطاق واسع لدراسة المسببات ، والأمراض ، وعوامل الخطر من بطانة الرحم 2،8،26-29 فضلا عن استكشاف رواية المداواة 14،30-34. نموذج القوارض من بطانة الرحم الناجم جراحيا يوضح أوجه تشابه كثيرة لهذا المرض في البشر ، بما في ذلك انخفاض الخصوبة والخصوبة والجينات المعدلة والتعبير 5،6،35،36 البروتين. أخذت معا ، مع انخفاض تكاليفها نسبيا وسهولة ، ونموذج من القوارض ايندو جراحيادائرة الهندسة المدنية بطانة الرحم هو نموذج ممتاز لبطانة الرحم لدى النساء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
شكر خاص لKassotis كريس وأودري بيلي لاستعراض نقدي لهذه المخطوطة وKorte سكوت الدكتور جوزيف بيمن ، Curfman أليسون ، كيمبال بول ، Neibreggue بريدجيت ، Redel يعقوب ، شرودر ايمي ، شتاينبرغ مايا ، وWinkeler ستايسي لمساعدتهم في تحسين من هذا النموذج في مختبرنا. تم توفير التمويل من المنح التدريبية السريرية Biodetectives (NIH T90) (كيب) ، جامعة ميزوري للعلوم الحياة الجامعية برنامج الفرص البحوث وMU مجلس البحوث ومنح المجلس MU البحوث والمعاهد الوطنية للصحة R21HD056441 (SCN).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wax pencil | Fisher Scientific | NC9954135 | |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-550-433 | |
| Eyedropper | Fisher Scientific | S79383 | |
| Standard light microscope for evaluating vaginal cytology smears | |||
| Buprenorphine HCL c3 (CARJET) 10X1ml | Butler Animal Health Supply | 022891 | |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14040-117 | |
| 10,000U/ml Penicillin, 10,000μg/ml Streptomycin in 0.85% NaCl | Hyclone | SV30010 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane non-rebreathing anesthetic system | |||
| Recirculating hot water heating pad | |||
| 30 ml syringe sheath | Fisher Scientific | 14-823-16G | |
| Powder free sterile gloves | Fisher Scientific | 19020558 | |
| Ophthalmic ointment | Major Pharmaceuticals | 10033691 | |
| Small electrical clippers | Wahl Clipper Corp. | 9861-600 | |
| Chlorhexidine scrub | Fisher Scientific | NC9863042 | |
| 70% Ethanol | |||
| Polylined sterile field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Size 3 scalpel | Fisher Scientific | 22-079-657 | |
| Number 10 scalpel blades | Fisher Scientific | 22-079-681 | |
| Small surgical scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5850 | |
| Small serrated semi-curved forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| 5-0 black braided silk suture | Ethicon Inc. | K870H | |
| Sterilized pyrex glass Petri dishes | Corning | 70160-101 | |
| 2 mm biopsy punch | Miltex Inc. | 33-31 | |
| Sterile gauze | Kendall | 1806 | |
| 6-0 black monofilament ethilon nylon suture | Ethicon Inc. | 697G | |
| Needle drivers (optional) | World Precision Instruments, Inc. | 500023 | |
| 5-0 undyed braided coated vicryl suture | Ethicon Inc. | J490G | |
| 9mm Autoclip wound clips | BD Biosciences | 427631 | |
| Autoclip applier & remover | BD Biosciences | 427630 | |
| 23G needle | BD Biosciences | 305193 | |
| 1cc syringe | BD Biosciences | 301025 | |
| 5X magnifying glass stand (optional) | Fisher Scientific | 14-648-23 | |
| 10% Buffered formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Calipers | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6466 | |
| Processing/embedding cassettes | Fisher Scientific | 15-197-700A | |
| Biopsy foam pads | Fisher Scientific | 22-038-222 | |
| RNAqueous RNA isolation kit | Ambion | AM1912 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Snap cap microcentrifuge flat top tube | Fisher Scientific | 02-681-240 | |
| Ketamine (optional) | Sigma-Aldrich | K4138 | |
| Domitor (medetomidine hydrochloride) (optional) | Tocris Bioscience | 2023 | |
| Antisedan (atipamezole) (optional) | Sigma-Aldrich | A9611 |
References
- Simoens, S., Hummelshoj, L., D'Hooghe, T. Endometriosis: cost estimates and methodological perspective. Hum. Reprod. Update. 13, 395-404 (2007).
- Grummer, R.
- Vernon, M. W., Wilson, E. A. Studies on the surgical induction of endometriosis in the rat. Fertil. Steril. 44, 684-694 (1985).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Induction of endometriosis in mice: a new model sensitive to estrogen. Reprod. Toxicol. 9, 233-238 (1995).
- Pelch, K. E. Aberrant gene expression profile in a mouse model of endometriosis mirrors that observed in women. Fertil. Steril. 93, 1615-1627 (2010).
- Flores, I. Molecular profiling of experimental endometriosis identified gene expression patterns in common with human disease. Fertil. Steril. 87, 1180-1199 (2007).
- Giudice, L. C., Kao, L. C.
- Lin, Y. J., Lai, L. ei, Y, H., Wing, L. Y. Neutrophils and macrophages promote angiogenesis in the early stage of endometriosis in a mouse model. Endocrinology. 147, 1278-1286 (2006).
- Fang, Z. Intact progesterone receptors are essential to counteract the proliferative effect of estradiol in a genetically engineered mouse model of endometriosis. Fertil. Steril. 82, 673-678 (2004).
- Fang, Z. Genetic or enzymatic disruption of aromatase inhibits the growth of ectopic uterine tissue. J. Clin. Endocrinol. Metab. 87, 3460-3466 (2002).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L., Birnbaum, L. Promotion of endometriosis by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in rats and mice: time-dose dependence and species comparison. Toxicol. Appl. Pharmacol. 138, 131-139 (1996).
- Foster, W. G. Morphologic characteristics of endometriosis in the mouse model: application to toxicology. Can. J. Physiol. Pharmacol. 75, 1188-1196 (1997).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Effect of surgically induced endometriosis on pregnancy and effect of pregnancy and lactation on endometriosis in mice. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 212, 332-337 (1996).
- Lu, Y., Nie, J., Liu, X., Zheng, Y., Guo, S. W. Trichostatin A, a histone deacetylase inhibitor, reduces lesion growth and hyperalgesia in experimentally induced endometriosis in mice. Hum. Reprod. 25, 1014-1025 (2010).
- Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J. Endocrinol. 13, 399-404 (1956).
- Whitten, W. K., Bronson, F. H., Greenstein, J. A. Estrus-inducing pheromone of male mice: transport by movement of air. Science. 161, 584-585 (1968).
- Goldman, J. M., Murr, A. S., Cooper, R. L. The rodent estrous cycle: characterization of vaginal cytology and its utility in toxicological studies. Birth. Defects. Res. B. Dev. Reprod. Toxicol. 80, 84-97 (2007).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586-e2586 (2011).
- Moen, M. H., Halvorsen, T. B. Histologic confirmation of endometriosis in different peritoneal lesions. Acta. Obstet. Gynecol. Scand. 71, 337-342 (1992).
- Cummings, A. M. Methoxychlor as a model for environmental estrogens. Crit. Rev. Toxicol. 27, 367-379 (1997).
- Fowler, R. E., Edwards, R. G. Induction of superovulation and pregnancy in mature mice by gonadotrophins. J. Endocrinol. 15, 374-384 (1957).
- Wilson, E. D., Zarrow, M. X. Comparison of superovulation in the immature mouse and rat. J. Reprod. Fertil. 3, 148-158 (1962).
- Lee, B., Du, H., Taylor, H. S. Experimental murine endometriosis induces DNA methylation and altered gene expression in eutopic endometrium. Biol. Reprod. 80, 79-85 (2009).
- Somigliana, E. Endometrial ability to implant in ectopic sites can be prevented by interleukin-12 in a murine model of endometriosis. Hum. Reprod. 14, 2944-2950 (1999).
- Hirata, T. Development of an experimental model of endometriosis using mice that ubiquitously express green fluorescent protein. Hum. Reprod. 20, 2092-2096 (2005).
- Story, L., Kennedy, S. Animal studies in endometriosis: a review. Ilar. J. 45, 132-138 (2004).
- Cummings, A. M., Hedge, J. M., Birnbaum, L. S. Effect of prenatal exposure to TCDD on the promotion of endometriotic lesion growth by TCDD in adult female rats and mice. Toxicol. Sci. 52, 45-49 (1999).
- Cummings, A. M., Metcalf, J. L. Effects of estrogen, progesterone, and methoxychlor on surgically induced endometriosis in rats. Fundam. Appl. Toxicol. 27, 287-290 (1995).
- Sharpe-Timms, K. L. Endometriotic lesions synthesize and secrete a haptoglobin-like protein. Biol. Reprod. 58, 988-994 (1998).
- Yavuz, E., Oktem, M., Esinler, I., Toru, S. A., Zeyneloglu, H. B. Genistein causes regression of endometriotic implants in the rat model. Fertil. Steril. 88, 1129-1134 (2007).
- Dmitrieva, N.
- Efstathiou, J. A. Nonsteroidal antiinflammatory drugs differentially suppress endometriosis in a murine model. Fertil. Steril. 83, 171-181 (2005).
- Becker, C. M. Endostatin inhibits the growth of endometriotic lesions but does not affect fertility. Fertil. Steril. 84, Suppl 2. 1144-1155 (2005).
- Becker, C. M. Short synthetic endostatin peptides inhibit endothelial migration in vitro and endometriosis in a mouse model. Fertil. Steril. 85, 71-77 (2006).
- Sharpe-Timms, K. L. Using rats as a research model for the study of endometriosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 955, 318-327 (2002).
- Stilley, J. A., Woods-Marshall, R., Sutovsky, M., Sutovsky, P., Sharpe-Timms, K. L. Reduced Fecundity in Female Rats with Surgically Induced Endometriosis and in Their Daughters: A Potential Role for Tissue Inhibitors of Metalloproteinase 1. Biol. Reprod. 80, (2009).
