Die Durchflusszytometrie ist ein leistungsstarkes Werkzeug, das die Isolierung und Untersuchung spezifischer Zellpopulationen ermöglicht. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Isolierung von LacZ-exprimierenden Zellen aus cochleären Geweben neonataler transgener Mäuse. Dissociierte cochleäre Zellen wurden mithilfe fluoreszenzmarkierter Substrate der β-Galactosidase vor der Trennung mittels Durchflusszytometrie markiert.
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Methodenartikel
Isolating LacZ-exprimierenden Zellen aus Maus Innenohrgeweben mittels Durchflusszytometrie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Isolierung spezifischer Zelltypen ermöglicht die Analyse seltener Zellpopulationen wie Stamm- oder Vorläuferzellen. Ein solcher Ansatz zur Untersuchung des Innenohrgewebes stellt aufgrund der geringen Anzahl der Zellen von Interesse und der wenigen transgener Reporter-Mausmodelle eine besondere Herausforderung dar. Hier beschreiben wir ein Protokoll, bei dem fluoreszenzmarkierte Sonden verwendet werden, um LacZ-positive Zellen aus den cochleären Geweben neugeborener Mäuse gezielt zu markieren.
Die häufigste Ursache für eine sensorineurale Schwerhörigkeit ist die irreversible Schädigung und der Verlust cochleärer Sinneshaarsinneszellen, die erforderlich sind, um Schallwellen in neuronale Impulse umzuwandeln. Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die auditorischen und vestibulären Organe der Maus Stamm- bzw. Vorläuferzellen enthalten, die regeneratives Potenzial besitzen könnten1,2. Diese Befunde erfordern weitere Untersuchungen, einschließlich der Identifizierung spezifischer Zelltypen mit Eigenschaften von Stamm- oder Vorläuferzellen. Der Wnt-Signalweg hat sich als entscheidend für die Aufrechterhaltung von Populationen mit Stamm- bzw. Vorläuferzellcharakter in mehreren Organsystemen erwiesen3–7. Kürzlich haben wir Wnt-reaktive, Axin2-exprimierende Zellen in der neugeborenen Cochlea identifiziert, deren Funktion jedoch weitgehend unbekannt ist8.
Um das Verhalten dieser Wnt-reaktiven Zellen in vitro besser zu verstehen, haben wir eine Methode zur Isolierung von Axin2-exprimierenden Zellen aus den Cochleae von Axin2-LacZ-Reporter-Mäusen9 entwickelt. Mithilfe der Durchflusszytometrie zur Isolierung von Axin2-LacZ-positiven Zellen aus neonatalen Cochleae können wir anschließend eine Vielzahl von Experimenten an lebenden Zellen durchführen, um ihr Verhalten als Stamm- bzw. Vorläuferzellen zu untersuchen. Hier beschreiben wir detailliert die Schritte zur Mikrodissektion der neonatalen Cochlea, zur Dissoziation dieses Gewebes, zur Markierung der LacZ-positiven Zellen mittels eines fluorogenen Substrats sowie zur Zellsortierung. Techniken zur Dissoziation der Cochlea in Einzelzellen und zur Isolierung cochleärer Zellen mittels Durchflusszytometrie wurden bereits beschrieben2,10–12. Wir haben diese Techniken modifiziert, um einen neuartigen Protokollablauf zur Isolierung von LacZ-exprimierenden Zellen aus der neonatalen Cochlea zu etablieren.
Protokoll
1. Mikrodissektion der Cochlea
- Bereiten Sie das Dissektionsmikroskop unter der Haube vor, indem Sie die Oberflächen mit 70 %igem Ethanol abwischen und Eisblöcke bereitstellen.
- Bereiten Sie 10–15 35-mm-Petri-Schalen unter sterilen Bedingungen vor und füllen Sie diese zur Hälfte (~2 ml) mit steriler Hank’s Balanced Salt Solution mit Calcium (HBSS).
- Bereiten Sie zwei 35-mm-Petri-Schalen unter sterilen Bedingungen vor und füllen Sie diese zur Hälfte (~2 ml) mit steriler 1x Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS).
- Sterilisieren Sie die Mikrozange in einem 50-ml-kegelförmigen Falcon-Röhrchen mit 70 %igem Ethanol.
- Verwenden S....
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Diskussion
Unabhängige Forschungsstudien haben eine begrenzte Regenerationskapazität in den neugeborenen Cochleae charakterisiert2,10,12,13. Mithilfe von GFP-Reporter-Mäusen und Durchflusszytometrie isolierten White und Kollegen spezifische cochleäre Stützzellen und fanden heraus, dass diese Eigenschaften von Vorläuferzellen aufweisen12.
Der kanonische Wnt-Weg wurde als Markierung für Stamm- bzw. Vorläuferzellpopulationen in mehreren Organsystemen nachgewiesen, darunter das Gehirn, .......
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Offenlegungen
Keine Interessenkonflikte erklärt.
Danksagungen
Wir danken S. Heller, K. Oshima, R. Nusse und Y. Zeng für fruchtbare Diskussionen sowie C. Tang, A. Lee, E. Liaw und dem Personal der Stanford Shared FACS Facility für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Howard Hughes Medical Institute Medical Research Training Fellowship, das Stanford University Medical Scholars-Programm (beide an T.A.J.), ein Stanford University Dean's Fellowship (an R.C.), die American Otological Society, die Triological Society, den Percy Memorial Award, den Akiko Yamazaki und Jerry Yang Faculty Scholar Fund sowie durch NIDCD/NIH K08 DC011043 (alle an A.G.C.).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Petrischale, Polystyrol, steril Geriner Bio-one 35 x 10 mm | VWR international | 82050-540 | |
| BD Falcon Zellseiger, steril, BD Biosciences, blau, 40 μm | VWR international | 21008-949 | |
| Hanks’ Puffergelösung mit ausgewogenem Salzgehalt (HBSS). Lösung mit Calcium, Magnesium und ohne Phenolrot, steril | VWR international | 45000-456 | |
| Cellstar Zentrifugenröhrchen, Polypropylen, steril, Greiner Bio-One, 50 ml | VWR international | 82050-346 | |
| Cellstar Zentrifugenröhrchen, Polypropylen, steril, Greiner Bio-One, 15 ml | VWR international | 82050-278 | |
| B-27 Serumfreies Supplement (50x), flüssig | Invitrogen | 17504-044 | |
| N-2-Zusatz (100x), flüssig | Invitrogen | 17502-048 | |
| bFGF, humanes basisches Fibroblastenwachstumsfaktor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| IGF-1, insulinähnlicher Wachstumsfaktor-1 aus Maus | Sigma-Aldrich | I8779 | |
| EGF, humaner epidermaler Wachstumsfaktor | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Dulbecco’s Modifiziertes Eagle’s Medium/Ham’s F-12 50/50 Mix: 1X, mit L-Glutamin und 15 mM HEPES | VWR international | 45000-350 | |
| BD Falcon Rundbodenröhrchen, Einweg, Polystyrol, 12x75 | VWR international | 60819-295 | |
| Trypsin, 0,25 % (1X) mit EDTA 4Na, flüssig | Invitrogen | 25200-056 | |
| ep Dualfilter TIPS 300 µL, 960 TIPS | Eppendorf | 22491245 | |
| Trypsininhibitor, Sojabohne, gereinigt | Worthington Biochemical | LS003570 | |
| BD Falcon 40 µm Zellseihen | BD Biosciences | 21008-949 | |
| Mehrfach-Platten, Polystyrol, Greiner Bio-One, unbehandelte Platten, 6 Vertiefungen | VWR international | 82050-846 | |
| Marker-Gen-FACS Blue Nachweiskit für LacZ-beta-Galactosidase | Markergen-Technologien | M0255 |
Referenzen
- Li, H., Liu, H., Heller, S. Pluripotent stem cells from the adult mouse inner ear. Nat. Med.. 9, 1293-1299 (2003).
- Oshima, K. Differential distribution of stem cells in the auditory and vestibular organs of the inner ear. J. Assoc. Res. Otolaryngol
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Nachdrucke und Genehmigungen
