אנו מתארים שיטה רגיש לזהות הרגולטורים postembryonic של ביטוי חלבונים לוקליזציה ב ג elegans באמצעות מסך RNAi מבוסס גנומית transgene משולב המבטא חלבון פונקציונלי, מתויג fluorescently.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans
במאמר זה
סיכום
תקציר
סי אלגנס הוכיחה להיות מערכת מודל ערך לגילוי ואפיון פונקציונלי של גנים רבים ושבילים גנים 1. כלים מתוחכמים יותר ומשאבים ללימודי במערכת זו יש להקל על הגילוי המתמשך של גנים עם פנוטיפים או תפקידים יותר עדינים.
כאן אנו מציגים פרוטוקול כללית התאמנו לזיהוי ג elegans גנים עם פנוטיפים postembryonic בעלי עניין באמצעות RNAi 2. הליך זה שונה בקלות assay הפנוטיפ של בחירה, בין אם על ידי אופטיקה אור פלואורסצנטי או על מיקרוסקופ לנתח או תרכובת. זה פרוטוקול ההקרנה מנצל את הנכסים הפיזיים של האורגניזם וכלים מולקולריים ג הקהילה elegans המחקר הפיק. כדוגמה, אנחנו מדגימים את השימוש transgene משולבת המבטאת מוצר ניאון במסך RNAi לזהות גנים הנדרשים לוקליזציה רגיל לכךהמוצר הזחלים בשלב מאוחר ומבוגרים. ראשית, השתמשנו ספריה זמינים מסחרית RNAi גנומית עם באורך מלא מוסיף cDNA. ספריה זו מאפשרת זיהוי מהיר של מועמדים רבים על ידי הפחתת RNAi של המוצר הגן המועמד. שנית, אנו שנוצר transgene משולב המבטא חלבון מתויג fluorecently שלנו עניין ברקע RNAi רגיש. שלישית, על ידי חשיפת בעלי החיים בקעו כדי RNAi, מסך זה מאפשר זיהוי של מוצרים גנים שיש להם תפקיד חיוני עובריים שאחרת להסוות תפקיד שלאחר עובריים בוויסות חלבון של עניין. לבסוף, המסך הזה עושה שימוש במיקרוסקופ המתחם מצויד לפתרון תא בודד.
פרוטוקול
1. זן הקרנת הבנייה
תכנון קפדני של זן ההקרנה היא קריטית להצלחה של המסך תוארה במקומות אחרים 3. עבור חוקרים מסוימים, באמצעות מאמץ המבטא מוצר גלוי מ transgene דרוש הניסוי. זנים רבים מחסה transgenes משולבים זמינים לחוקרים CGC או אדם פרטי. אם זן מהונדס נדרש המסך אבל הוא לא זמין, אז זה יכול להיות שנוצר באמצעות שיטת שפורסם כמו 4 הפצצה, UV / tmp 5, או מוס transposon הכנסת 6. כדי להמחיש החלבון שלנו של עניין, הכנסנו את רצף ה-GFP קידוד במסגרת רצף cDNA בוגרת (השתמשנו dbl-1 ברצף). כי זה חלבון היתוך GFP אינו גלוי על....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שיטת ההקרנה RNAi המוצג כאן מאפשר ניתוח רגיש ומהיר של מוצרי גנים הנדרשים הפנוטיפ (או המהונדס) רגיל postembryonic. הדוגמה המוצגת היא המסך של גנים המעורבים בלוקליזציה subcellular של חלבון מתויג fluorescently. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי לזהות את הגנים המשפיעים על פנוטיפים postembryonic אחרים בעלי עניין.
שיטה זו מנצלת את גישת הגן המועמד באמצעות הספרייה RNAi. מסכי קדימה גנטיות באמצעות טכניקות mutagenesis ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין לנו מה למסור.
תודות
המחברים מבקשים להודות ד"ר ריק פאדג'ט (וקסמן המכון, אוניברסיטת רוטגרס, ניו ג'רזי) על המתנה של dbl-1 cDNA וד"ר כריסטופר Rongo (מכון וקסמן, אוניברסיטת רוטגרס, ניו ג'רזי) לסמן זריקה. המעבדה ד"ר Barth של גרנט ביצעה את האקדח גן הפצצה לשילוב מספר נמוך עותק של מבנה ה-GFP-מתויג-1 dbl. גרסיה רנה המעבדה סיוע טכני במהלך היצירה של texIs100. גרסיה רנה, Lints רובין, ו Hongmin צ'ין מעבדות סיפק ייעוץ פרודוקטיבי. עבודה זו מומנה על ידי הזנק קרנות מהמחלקה TAMHSC לרפואה מולקולרית תאית. היקף המתחם confocal דיסק מסתובב נרכשו במימון מחלקת ומכללת TAMHSC המשרד לרפואה של דין.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
| NGM אגר | הצמיחה נמטודות בינוני | IPM מדעי, Inc | ניתן להכין בעקבות פרוטוקול אגר NGM 25 |
| M9 בינוני | 22 מ"מ KH 2 PO 4, 42 מ"מ Na 2 HPO 4, 86mM NaCl, 1 mM MgSO 4 | 26 | |
| אגר אגר, | EMD כימיקלים בע"מ | 1.01614.1000 | 2% במים צלחות NGM. 4% במים רפידות שקופיות מיקרוסקופ (החיטוי בתחילה במיקרוגל כדי להמיס לאחר מכן). |
| Bacto Peptone | בקטון דיקינסון - Difco CP | 211677 | 0.25% |
| IPTG | המחקר מוצרים אינטרנשיונל קורפ | I56000-5.0 | 1 הריכוז הסופי mM |
| carbenicillin | המחקר מוצרים אינטרנשיונל קורפ | C46000-5.0 | 50 מיקרוגרם / מ"ל דילול עובד |
| LB מרק לנוקס | בקטון דיקינסון - Difco CP | 240230 | 20 גר '/ ליטר |
| טטרציקלין | סיגמא | 268054 | 12.5 מיקרוגרם / מ"ל דילול עובד |
| נתרן hypochlorite | כל מותג | בית 5% אקונומיקה | השתמש אקונומיקה טרי. |
| סודיום הידרוקסיד | כל מותג | CAS 1310-73-2 | 5 N המניות |
| M9 בינוני | Wormlab ספר המתכונים | http://130.15.90.245/wormlab_recipe_book.htm # Commonlab | 26 |
| levamisol | סיגמא | 31742 | 100 מיקרומטר - 1 דילול עובד mM |
| אזיד הנתרן | פישר סיינטיפיק | S227 | 10 מ"מ דילול עבודה M9 |
| 24 גם צלחת | גריינר Bio-One | 662160 | VWR מפיץ |
| מיקרוסקופ שקופיות | כל מותג | 75 x 25 x 1 מ"מ | |
| כיסוי מיקרוסקופ תלושי | כל מותג | 22 x 22 מ"מ No.1.5 | השתמש עובי המומלץ על ידי היצרן מיקרוסקופ. |
| תרכובת מיקרוסקופ | Carl Zeiss, Inc | A1m | השתמש יעדים ומסננים כדי להתאים את הצרכים של הניסוי. |
| התקשורת משאבת | Manostat משאבת Varistaltic | קייט המודל # 72-620-000 | השתמש בצינור ואת ההגדרות המתאימות למכשיר |
מקורות
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br. J. Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Lamitina, T. Functional genomic approaches in C. elegans. Methods in Molecular Biology. 351, 127-138 (2006).
- Boutros, ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
